一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明专利技术使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及检测
，尤其涉及一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，属于鲑科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Oncorhynchus)，自19世纪起在美国开始淡水养殖，我国曾从朝鲜、美国、日本等国多次引种，目前在20多个省市区都有人工养殖，是国内养殖范围较广的冷水鱼类。生食淡水养殖的虹鳟鱼掺假的三文鱼，相比海水养殖的三文鱼，极易带来寄生虫感染的风险。因此，迫切需要建立快速准确的检测手段，用于鉴定三文鱼中掺假的虹鳟。随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)为基础的DNA分析成为目前物种鉴定方法的主流。例如，DNA条形码技术和荧光定量PCR等。但DNA条形码技术需要对PCR扩增产物进行测序，成本高且耗时较长；荧光定量PCR对设备和操作水平的要求较高；近年由于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA技术)、侧流层析试纸条检测技术(LFS)的兴起，本专利技术通过RPA-LFS技术快速鉴定虹鳟鱼，以期为三文鱼中是否有虹鳟鱼掺假检测带来新的技术参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为om-F、om-R，且序列分别为ATGCATGCAATCCGTAGCTACCCTCTCCCCTCCAC、Biotin-AAGCTAATATTTTCTGTGCCAAGCAGTCAGTGGGT，其探针为om-P，且序列为FITC-ACTAGGATTTATGGCTGAACGTTTCTATAG[THF]GTTTTGCTGAGTAGAC-/C3-spacer/。一种虹鳟鱼特异性的检测试剂盒，其包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5'端用FluoresceinIsothiocyanate(FITC)标记，且距5'端30bp、距3'端16bp的C碱基处使用[THF]进行替换，所述3'端用C3-spacer进行末端封闭，所述正反向引物长度为35bp，所述探针长度46bp，所述检测试剂盒包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂。优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。本专利技术的有益效果：本专利技术使用RPA结合胶体金试纸条快速检测虹鳟鱼，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。附图说明图1为虹鳟鱼和大西洋鲑鱼mb基因序列不保守区比对结果；图2为本专利技术实施例中RPA扩增产物的侧流层析试纸条检测结果；图3为本专利技术实施例中RPA-LFS反应温度和反应时间筛选结果；图4为本专利技术实施例中RPA-LFS最低检出限检测结果；图5为试纸条组装检测原理示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为om-F、om-R，且序列分别为ATGCATGCAATCCGTAGCTACCCTCTCCCCTCCAC、Biotin-AAGCTAATATTTTCTGTGCCAAGCAGTCAGTGGGT，其探针为om-P，且序列为FITC-ACTAGGATTTATGGCTGAACGTTTCTATAG[THF]GTTTTGCTGAGTAGAC-/C3-spacer/。一种虹鳟鱼特异性的检测试剂盒，其包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条，所述反向引物5'端用生物素进行标记，所述探针5'端用FluoresceinIsothiocyanate(FITC)标记，且距5'端30bp、距3'端16bp的C碱基处使用[THF]进行替换，所述3'端用C3-spacer进行末端封闭，所述正反向引物长度为35bp，所述探针长度46bp，所述检测试剂盒包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。试验材料虹鳟鱼和大西洋鲑鱼基因组均由本实验室保存；实际检测的鱼样本通过线上淘宝网店和附近餐馆购买；nfokit购自英国TwistDX公司；侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；PCR清洁试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；Qubit4购自ThermoScientific；MonAmpTMSYBRGreenqPCRMix和MonAmpTMPCRMix均购自莫纳生物科技有限公司；本研究所用引物和探针均由通用生物系统(安徽)有限公司合成；罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，购自罗氏制药。试验方法引物及探针设计从NCBI上获取虹鳟鱼线粒体细胞色素b(mb)区域基因序列(GenbankNo.FR908943.1)和大西洋鲑鱼mb基因序列(GenbankNo.AGKD04001111.1)，用DNAMAN对序列进行比对找到同源性低的区域，比对结果如1所示，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物，用Geneious软件在正反向引物间设计特异性探针，用Primer5.0验证引物探针特性，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生，引物和探针序列如表1所示。表1引物和探针序列RPA-LFS检测引物和探针引物和探针筛选使用nfokit，其反应体系：om-F(10μM)2.1μL、om-R(10μM)2.1μL、om-P(10μM)0.6μL、RehydrationBuffer29.5μL、ddH2O11.2μL、加入冻干粉，混匀、Template2μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束即刻置于冰上终止反应，分别使用琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条对扩增产物进行检测，检测结果如图2所示。最佳反应温度和时间将反应混合物立即在37℃下孵育30min，采用方阵法确定RPA反应的最佳反应温度(30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃)，反应时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min)，RPA-LFS最佳反应温度和时间分别为：37～42℃和15min，结果如图3所示。最低检出限测定由于三文鱼中掺假虹鳟鱼的量不确定，实验室条件下在方法建立过程中检测的模板浓度通常较高，在实际检测中对于不通含量的掺假均需要非常灵敏的检出，所以要对最低检出下限进行测定。制备102～10-2ng/μL浓度的虹本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为om-F、om-R，且序列分别为ATGCATGCAATCCGTAGCTACCCTCTCCCCTCCAC、Biotin-AAGCTAATATTTTCTGTGCCAAGCAGTCAGTGGGT，其探针为om-P，且序列为FITC-ACTAGGATTTATGGCTGAACGTTTCTATAG[THF]GTTTTGCTGAGTAGAC-/C3-spacer/。/n

【技术特征摘要】
1.一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为om-F、om-R，且序列分别为ATGCATGCAATCCGTAGCTACCCTCTCCCCTCCAC、Biotin-AAGCTAATATTTTCTGTGCCAAGCAGTCAGTGGGT，其探针为om-P，且序列为FITC-ACTAGGATTTATGGCTGAACGTTTCTATAG[THF]GTTTTGCTGAGTAGAC-/C3-spacer/。


2.一种虹鳟鱼特异性的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵盼盼，董井泉，高嵩，王蕾，杨潇含，董宇，张玮，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，连云港海恒生化科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32