一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用。以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，鉴定山羊PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472‑16491位InDel位点的基因型。根据PPP3CA基因InDel位点的不同基因型与陕北白绒山羊产仔数的关联分析结果，确定了PPP3CA基因InDel位点的基因型可作为提高山羊产仔数的DNA标记。本发明专利技术通过快速、精准的检测与山羊产仔数密切相关的InDel标记，可快速建立山羊优势遗传资源群体，从而加快山羊繁殖性状的标记辅助选择育种进程。

【技术实现步骤摘要】
一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失多态性(InDel)的检测，特别涉及快速、精准的检测与山羊产仔数相关的PPP3CA基因InDel标记。
技术介绍
动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术以及以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)育种技术根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择，通过在DNA水平上分析个体的遗传组成，实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性，在早期选择、无损害性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与性状的相关性，是标记辅助选择技术应用的前提和关键。插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起的DNA序列的改变，插入或缺失片段的长度在1-50bp之间。从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行InDel检测，利用InDel分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。随着比较基因组学的深入研究，InDel为理论研究和遗传育种应用提供了大量的遗传信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点。InDel与SNP均是源于单突变事件，突变频率较低，相对比较稳定；在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)。作为一种重要的遗传标记来源，InDel遍布于整个基因组，频率仅次于SNP，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。2005年Schnabel等人结合SSR标记和InDel标记对控制奶牛产奶量进行了研究，并成功进行了精细定位。InDel的研究目前多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因的InDel标记的挖掘与应用亟待深入。随着社会对山羊产品的需求不断加强，在高产、优质和高效的山羊育种目标上，为了更早、更快的培育出地方山羊优良品种，需要在DNA水平上筛查和检测与山羊产仔数密切相关的DNA标记。PPP3CA是蛋白磷酸酶3催化亚基α编码基因。目前尚未见到山羊PPP3CA基因与产仔数标记辅助选择相关的DNA标记的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用，从而可以通过分子标记辅助选择加快山羊良种选育速度。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测山羊个体全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增包含PPP3CA基因20-bp插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)的片段；对PCR的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊个体在该插入/缺失多态性位点的基因型。优选的，所述的引物对P1为：上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。优选的，所述PCR采用的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。优选的，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为179bp的一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为179bp和159bp的两条带纹，缺失/缺失基因型表现为159bp的一条带纹(DD)。一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1。上述山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型(ID)可以作为提高山羊产仔数的DNA标记(具体为InDel标记)。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以对山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)进行基因分型鉴定，根据对该插入/缺失多态性位点与陕北白绒山羊产仔数进行关联分析的结果，首次发现PPP3CA基因与山羊产仔数显著相关，并具有可提高山羊产仔数的DNA标记。本专利技术的检测方法简单、快速、低成本，可用于精准建立产仔数优异的山羊种群，从而加快山羊繁殖性状的标记辅助选择育种进程。附图说明图1为山羊PPP3CA基因PCR扩增(引物对P1)产物3.0％琼脂糖凝胶电泳的结果；其中：M为MarkerI泳道，其他个别泳道出现的三条带表示存在非特异性扩增，但并不影响对基因型的识别。图2为山羊PPP3CA基因PCR扩增产物测序图；其中：上半部分表示基因型为II，下半部分表示基因型为ID，黑色方框标出的部分表示20-bp缺失序列(NC_030813.1:g.16472-16491delATCAGGATTGGCTATATACT)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述实施例是对本专利技术的解释，而不是对本专利技术保护范围的限制。本专利技术利用PCR及琼脂糖凝胶电泳的方法，对山羊PPP3CA基因16472-16491位(NC_030813.1)产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊产仔数进行关联分析，确定了可以作为山羊分子育种中辅助选择的候选分子标记。1.实验药品与试剂1.1生化试剂与生物学试剂①TaqDNA聚合酶(购自Fermantas，即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③MarkerI(购自天根生化科技(北京)有限公司)。1.2普通试剂普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。1.3溶液与缓冲液所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)、25min。配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。1)提取组织样DNA所用溶液①2mol/LNaCl：11.688gNaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：lmo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增PPP3CA基因部分片段，对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定PPP3CA基因插入/缺失多态性位点的基因型，所述插入/缺失多态性位点位于PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472-16491位。/n

【技术特征摘要】
1.一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增PPP3CA基因部分片段，对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定PPP3CA基因插入/缺失多态性位点的基因型，所述插入/缺失多态性位点位于PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472-16491位。


2.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增引物对为：
上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；
下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。


3.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。


4.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。


5.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失...

【专利技术属性】
技术研发人员：白洋洋，王新雨，蓝贤勇，潘传英，陈宏，雷初朝，黄永震，朱海鲸，董书伟，屈雷，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61