本发明专利技术涉及一种对亲水气单胞菌血清型O抗原分子分型的检测方法及应用。本发明专利技术以亲水气单胞菌O抗原基因簇特异基因为靶基因,设计并筛选了用于亲水气单胞菌的O抗原分型的引物及MGB探针,并建立了相应的实时荧光PCR(RT‑PCR)检测方法,为利用分子生物学手段对亲水气单胞菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明专利技术的MGB探针检测水中的亲水气单胞菌,并且对其进行O抗原分型,具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。
【技术实现步骤摘要】
一种对亲水气单胞菌血清型O抗原分子分型的检测方法及应用
本专利技术涉及对亲水气单胞菌株O抗原分型的Taqman-MGB技术及其制备方法。本专利技术还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。
技术介绍
亲水气单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是一种机会性致病菌。但近年来的研究表明在宿主全身和局部防御功能减退时可作为一重要致病菌而引致较严重的感染,甚至有可能致命。本菌属于类弧菌科,有单鞭毛,菌体两端钝圆,广泛存在于自然界,在水和土壤中、河水、湖水、海水、游泳池水和供水系统中均可分离出本菌。在鱼类等变温动物中它是最常见的机会性病原体,也是一种重要的人类病原体。已知不同菌株的亲水气单胞菌不仅会引起皮肤感染和胃肠炎,还会引起全身性问题,如脑膜炎、腹膜炎、坏死性筋膜炎和溶血性尿毒症综合征。免疫功能低下的肝病、创伤或癌症患者被认为有发生致命性亲水气单胞菌感染和脓毒症的高风险。亲水气单胞菌感染的发病机制非常复杂,有很多因素,依赖于几个毒力因子,如O抗原、荚膜、脂多糖(LPS)、S层蛋白质、外毒素、铁结合系统和分泌系统。在这些毒力因子中,细菌细胞表面存在的荚膜多糖(K抗原)和O多糖(O抗原)等细菌多糖对宿主-病原体的相互作用极其重要,因为它们在粘附、细胞识别和生物膜形成方面发挥着关键作用。根据O抗原的多样性可以对亲水气单胞菌的不同菌株进行分型鉴定。TaqMan-MGB实时荧光PCR(Real-timefluorescencePCR)技术原理:将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针,其5'末端携带荧光基团,如FAM、TET、VIC、HEX等,3'端携带淬灭基团,如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan-MGB探针是近年来在TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′端增加了MGB分子,这种物质能够提高探针的退火温度(Tm值),从而使它能够分辨1个碱基的差别,完全配对,有荧光信号;只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30nt长度,Tm为68-70℃。在探针的5'末端,避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCTBiotechnologyCorporation(中国北京)合成,分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素(FAM)和小沟结合(MGB)部分。引物的长度约为25nt,Tm在55-60℃之间。产生的PCR产物在50-200bp之间。引物由Invitrogen(中国上海)合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20nt(通常为10nt或更少),则可能更好。利用TaqmanMGBPCR检测时,扩增反应在25μL的总体积中进行,包括12.5μLPremixExTaqTM(Takara),各0.3μL10μM正向和反向引物,0.3μL10μM探针,0.2μLROXII,0.3μLDNA和11μlddH2O。一个方案包括在95℃下进行3分钟的初始变性步骤,然后在95℃下变性15秒,在60℃下退火45秒进行40个循环,一式三份进行7500实时PCR系统(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA),随后利用仪器(如ABI7500)进行检测和结果分析。反应阳性的判断标准为Ct值<30且出现扩增曲线。
技术实现思路
为实现上述目的,本专利技术公开了对样品中亲水气单胞菌O抗原分型的MGB探针,该探针含有5'报告染料(FAM)和3'非荧光猝灭剂(NFQ),在3'末端与小沟结合物(MGB)缀合;其主要特征在于所述的亲水气单胞菌血清型O抗原分型指的是:从亲水气单胞菌血清型的O抗原基因簇特异基因序列,具有从SEQIDNO:17-SEQIDNO:24所示的探针序列。本专利技术所述对样品中亲水气单胞菌血清型O9、O10、O19、O24、O25、O29、O30、O44八种血清型O抗原分型的TaqMan引物,其特征在于所述的引物序列:具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:16所示的引物序列。本专利技术进一步公开了对样品中亲水气单胞菌血清型O抗原分型的MGB探针,用于特异性快速检测亲水气单胞菌血清型O抗原分型方面的应用。其中该MGB探针用于亲水气单胞菌血清型中的O抗原分型检测。所述的亲水气单胞菌指的是分离于任何适合亲水气单胞菌生活的环境中所得到的样品的纯培养物的粗提液。实验结果显示本专利技术可以在较低的DNA浓度下对亲水气单胞菌血清型O抗原进行分型。本专利技术提供的一种检测环境中亲水气单胞菌血清型的Taqman-MGBPCR体系,该体系包括:PremixExTaqTM(Takara),10μM正向和反向引物,10μM探针,ROXII,0.3μLDNA和ddH2O。其主要特征在于所述的根据从亲水气单胞菌血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物和探针:(1)从亲水气单胞菌血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用PrimerExpress3.0设计的引物长度约为25nt,Tm在55-60℃之间;PCR产物在50-200bp之间。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20nt(通常为10nt或更少),则可能更好。(2)从亲水气单胞菌血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用PrimerExpress3.0设计的探针长度为15-30nt,Tm为68-70℃。在探针的5'末端,避免了可能引起荧光猝灭的G的存在,分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素(FAM)和小沟结合(MGB)部分。本专利技术是Taqman-MGBPCR技术的实际应用,用于亲水气单胞菌血清型分型鉴定。由上述的技术方案可见,本专利技术首次将Taqman-MGBPCR技术引入亲水气单胞菌血清型O抗原分型领域,建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中亲水气单胞菌血清型检测MGB探针及其检测方法,利用本专利技术的MGB探针可以达到鉴定样品中常见的亲水气单胞菌血清型菌株的目的,由于操作简便,准确性高,重复性强,该专利技术对于各级医疗部门实时快速检测样品中亲水气单胞菌抗原分型具有重要的应用价值。附图说明图1为亲水气单胞菌血清型探针阳性检测;其中1-1为O9血清型探针阳性结果:Ct=24.77;1-2为O10血清型探针阳性结果:Ct=16.96;1-3为O19血清型探针阳性结果:Ct=19.9;1-4为O24血清型探针阳性结果:C本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对样品中亲水气单胞菌血清型O抗原分型的Taqman特异性引物,其特征在于具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种对样品中亲水气单胞菌血清型O抗原分型的Taqman特异性引物,其特征在于具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述特异性引物的MGB探针,该探针含有5'报告染料(FAM)和3'非荧光猝灭剂(NFQ),在3'末端与小沟结合物(MGB)缀合;其主要特征在于具有SEQIDNO:17-...
【专利技术属性】
技术研发人员:王磊,鲁阁阁,王敏,刘斌,郭玺,
申请(专利权)人:南开大学,
类型:发明
国别省市:天津;12
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