本发明专利技术基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。引物Atf/Atr和探针AtProbe可特异性地在槟榔黄化病发病组织中检测到植原体信号，每个反应微滴生成数大于10000，绝对定量结果可信。基于建立的槟榔黄化植原体ddPCR技术检测分析表明：在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍；本发明专利技术建立的ddPCR检测技术对于槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治等研究具有较为重要的意义。
Detection kit, method and application of areca yellow phytoplasma by microdrop digital PCR
【技术实现步骤摘要】
槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒、方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种微滴式数字PCR检测试剂盒，具体涉及一种基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。
技术介绍
植原体是一类寄生于植物韧皮部、尚不能分离纯化的原核致病菌(Doietal,1967)。槟榔(ArecacathecuL.)是一种棕榈科常绿乔木，我国重要的南药资源之一，具有很高的药用价值和经济价值。由植原体引起的槟榔黄化病是是我国海南槟榔生产上的一种毁灭性病害。我国槟榔黄化病已由发病初期的海南省屯昌县蔓延至海南省琼海、万宁、陵水、文昌、琼中、定安、乐东、保亭、三亚、五指山等10余个市县，在海南不同地区的槟榔产区均有不同程度的发生，且发病地区及面积仍在不断扩大，严重影响我国槟榔产业健康可持续发展(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010)。植原体病害是系统性侵染病害，尚无有效治疗药剂，其扩散传播途径包括自然状态下的刺吸式口器昆虫、菟丝子传播和人为状态下的种苗、嫁接传播，从源头上杜绝病原是防止此类病害流行的最常用也是最根本的方法。因此，高灵敏度的植原体检测方法的建立在植原体病害各方面的研究中都至关重要，特别是在病害监测、种苗检疫及综合防治方面占据着无法替代的地位并发挥着关键作用。槟榔黄化病在中国、印度和斯里兰卡均有报告(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010；Ramaswamyetal,2013；Silvaetal,2015)。引起槟榔黄化病的病原包括16SrI-B亚组(Muddumadiahetal.,2014；周亚奎等,2010)、16SrI-G(车海彦等,2010a)、16SrXI组(Ramaswamyetal,2013)、16SrXIV组(Silvaetal,2015)等不同组或亚组植原体株系。基于不同组或亚组的植原体目前已建立了巢式PCR(罗大全等,2001；车海彦等,2011)、实时荧光PCR(车海彦等,2011；Nairetal.,2014)、LAMP检测技术(Nairetal,2016)等检测技术。针对海南槟榔黄化植原体快速、便捷检测方面，车海彦等基于海南16SrI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针组合，建立了海南16SrI组槟榔黄化植原体实时荧光PCR快速检测方法(车海彦等,2011)。Nair等(2014)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因建立起适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的SYBRgreen法实时荧光PCR技术。Nair等(2016)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因建立适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的LAMP检测体系。不同检测技术检测灵敏度差异较大，基于植原体16SrRNA基因序列构建重组质粒的灵敏度分析表明：巢式PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度的为3.17×104copies/μL(任争光等,2015)；荧光定量PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度为3.17×102copies/μL(任争光等,2015)；LAMP检测技术能达到的DNA模板浓度为5.3×101copies/μL(Yuetal,待发表数据)。微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)采用一种全新的方式进行核酸分子的定性定量，即在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的荧光PCR反应体系“分割”成数万个纳升级的微滴，经PCR扩增后，对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，从而将荧光模拟信号数字化，因此该技术被称为“数字PCR”(www.bio-rad.com；Dayetal,2013)。最终根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，分析软件即可给出待检靶标分子的起始拷贝数浓度(www.bio-rad.com；Dayetal,2013)。与传统PCR、定量PCR相比，ddPCR检测结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。其定量的结果不再依赖于Cq值而直接给出靶标序列的起始拷贝数浓度，实现真正意义上的绝对定量(Dayetal,2013)。槟榔黄化植原体在发病槟榔组织中含量较低，且浓度分布不均(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010)。因此，为了精确、灵敏地检测鉴定待检槟榔组织中植原体的有无及分布情况，建立槟榔黄化植原体高灵敏度检测技术势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析，检测灵敏较高，在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，含有槟榔黄化植原体ddPCR检测特异性引物对和特异性探针，其中，引物Atf的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，引物Atr的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，探针AtProbe的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示。具体地，SEQIDNO:1序列为5'AAATTTATACGAAACAAACCGCATTTA3'；SEQIDNO:2序列为5'ACGTGAGCATAGTGACGTTTTTC3'；SEQIDNO:3序列为5'AGCAGCTATTACCCAAGTTTTGTCTAC3'。进一步地，所述探针AtProbe的5’端由VIC修饰，3’端由BHQ1修饰。进一步地，本专利技术检测到的槟榔黄化植原体最低浓度为0.07copies/μL。本专利技术槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒在槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测方法，其中，将总体积为24μLddPCR反应体系放入微滴生成仪中生成微滴，将生成微滴后的反应体系放入梯度PCR仪中进行扩增，扩增结束后将PCR产物放入微滴读取仪中，通过软件读取数据，每份样品重复检测3次；ddPCR反应体系总体积为24μL，反应体系包括12μLddPCR预混液NodUTP，900nM引物Atf/Atr10μM，250nM探针AtProbe10μM，DNA模板1μL，加ddH2O补齐至24μL。进一步地，ddPCR反应条件为95℃10min；94℃30sec，53℃60sec，共40个循环；98℃10min。本专利技术每个反应微滴本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：含有槟榔黄化植原体ddPCR检测特异性引物对和特异性探针，其中，引物Atf的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示，引物Atr的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，探针AtProbe的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：含有槟榔黄化植原体ddPCR检测特异性引物对和特异性探针，其中，引物Atf的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，引物Atr的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，探针AtProbe的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示。
2.根据权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针AtProbe的5’端由VIC修饰，3’端由BHQ1修饰。
3.根据权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于：检测到的槟榔黄化植原体最低浓度为0.07copies/μL。
4.权利要求1所述的槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒在槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治的应用。...
【专利技术属性】
技术研发人员：于少帅，覃伟权，唐庆华，宋薇薇，赵蕊玲，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院椰子研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46
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