一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，包括上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:2所示，上游内部引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示，下游内部引物BIP，其序列如SEQ ID NO:4所示，环引物LF，其序列如SEQ ID NO:5所示。本发明专利技术的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等特点，检测流感嗜血杆菌操作简单、价格低廉、耗时短，适用于欠发达地区医疗单位推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒及使用方法
本专利技术属于生物医学
，涉及一种试剂盒，具体来说是一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒及使用方法。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是一种革兰氏阴性杆菌，由于在人工培养中，必需在培养基中加入新鲜血液，Hi才能生长，故命名为“嗜血杆菌”。根据荚膜多糖成分，Hi可分为a–f6个血清型和不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)。在这几种亚型Hi中，b型(Hib)毒性最强，是导致机体感染的最主要流感嗜血杆菌，能引起脑膜炎、中耳炎、骨髓炎、肺炎、关节炎和其他软组织感染。在老年人群中，Hib是急性下呼吸道感染最主要的病原菌、而慢性支气管炎常由NTHi引起。在小儿，特别是婴幼儿，除了引起急性呼吸道感染，Hib也是引起脑膜炎的主要病原菌，必须高度重视流感嗜血杆菌和其他病原引起的呼吸道感染的临床症状非常相似，因而很难通过临床表现来判断患者是否感染了流感嗜血杆菌，只能通过实验室诊断进行鉴定。临床上的常规的检测方法包括菌落的分离、培养，然后再采用生化方法鉴定菌种，耗时3天，且操作复杂、检测成本高。目前也有少数实验室采用聚合酶链式反应(PCR)技术检测。PCR法快速、灵敏度特异性高，但实验设备价格较高、耗时长，且需要专业人员进行操作，难以在基层或欠发达地区进行推广使用。环介导等温扩增(LAMP)是一种新型的核酸检测方法，只需要加入4-6条引物便可在BstDNA聚合酶的作用下在63℃恒温下进行核酸扩增。与PCR相比，LAMP只需要恒温即可进行扩增，不需要复杂的变温步骤，而且检测时间更短，45min即可得到结果。值得一提的是，LAMP的灵敏度更好，检测限可达10拷贝数/反应，由于引物是根据靶序列的6个不同区域设计的，因此具有高度特异性。基于它的多种优点，LAMP已逐渐被用于各种核酸检测和诊断应用中。目前现有的LAMP检测流感嗜血杆菌的试剂盒，都是使用钙黄绿素通过终点显色法判断结果。但终点显色法必须在60min时立刻观察结果，否则时间过长极易出现假阳性结果影响判断。终点显色法通过裸眼观察颜色变化从而判断结果，这样的操作非常容易引起误差。因此我们利用实时荧光曲线进行结果判断，SYBRGreenI是一种能够激发绿色激发光的染料，能够与双链DNA的双螺旋小凹槽区域进行结合，使得该区域的荧光增强。通过实时荧光检测仪能够得到实时荧光曲线，得到更加清晰直观的结果。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒及使用方法，所述的这种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒及使用方法要解决现有技术中针对现有的流感嗜血杆菌检测时间长、成本高且操作复杂的技术问题。本专利技术的环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，包括如下的引物：具体引物序列如下：上游外部引物F3：TGAGCTACAAAAAGGCGA(SEQIDNO:1所示)下游外部引物B3：GGATCAACATCATACAAACGAC(SEQIDNO:2所示)上游内部引物FIP：CACTCATCAAACGAATGAGCGTAAAAATCGGGATTTTAGGGC(SEQIDNO:3所示)下游内部引物BIP：TCTATGAGTATCTCTTGGCCGTTAAAACGCAGATTATCCATCC(SEQIDNO:4所示)环引物LF：GGGCATTCCAAGGCAGCT(SEQIDNO:5所示)进一步的，所述试剂盒还包括环介导等温扩增反应试剂和荧光染料。进一步的，所述试剂盒还包括流感嗜血杆菌的阳性质控标准品和/或作为阴性对照的无核糖核酸酶的去离子水。进一步的，所述环介导等温扩增反应试剂包括：BstDNA聚合酶和10mMdNTP混合物(A610056,生工生物)。进一步的，所述荧光染料为SYBRGreenI，浓度为5×。进一步的，所述外引物F3浓度为0.2M、外引物B3浓度为0.2M、内引物FIP浓度为1.6M、内引物BIP浓度为1.6M、环引物LF的浓度为0.6M。进一步的，上述检测流感嗜血杆菌试剂盒，所述阳性质控标准品为携带流感嗜血杆菌DNA片段的pMD19-T载体。其构建方法为(1)通过PCR合成流感嗜血杆菌DNA片段，具体序列如SEQIDNO.6所示。(2)使用pMD19-TVectorCloningKit连接PCR产物并克隆到pMD19-T载体中。(3)将连接产物的pMD19-T载体转入大肠杆菌TOP10中培养过夜。(4)对重组质粒进行测序并与GenBank的序列进行匹配，以确定克隆的基因序列的正确性。(5)抽提质粒并测定浓度，储存在-20℃。本专利技术的另一目的在于提供一种上述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：S1，提取样本DNA，样本可以是鼻咽拭子、痰液、关节液、感染分泌物脑脊液、脑脊液等；S2，将样本DNA与环介导等温扩增反应试剂、荧光染料和引物组进行混合得到混合反应体系；S3，将混合反应体系置于实时荧光检测仪并将反应温度设置为63℃，反应45min；S4，反应结束后，根据实时荧光曲线判断样本中是否含有流感嗜血杆菌。本专利技术的优势在于：(1)利用LAMP方法能够简单快速地(45min内)检测样本中流感嗜血杆菌。(2)检测反应中运用了5条特异性引物，相较于普通PCR的2条特异性引物，检测的特异性大大提高。(3)检测的灵敏度高，本专利技术的检测低限达到500拷贝/ml。(4)本专利技术采用恒温扩增技术，恒温方法显著降低机器要求，且操作极为简便。因此，本专利技术的试剂盒具有高特异性、高灵敏度、快速检测等优点，检测流感嗜血杆菌操作简单、价格低廉、耗时短，适用于各级医疗机构的临床实验室和欠发达地区医疗单位推广使用。适用于。附图说明图1显示了LAMP流感嗜血杆菌试剂盒检测阴性、阳性质控品和临床样本实时曲线结果图。图2显示了LAMP流感嗜血杆菌试剂盒灵敏度分析实时曲线结果图。图3显示了LAMP流感嗜血杆菌试剂盒特异性分析实时曲线结果图。具体实施方式实施例1：引物设计LAMP反应体系中引物设计的基本原则是，外部引物组的Tm值控制在55–63℃，碱基长度为15–25个。内部引物组5’端20个碱基左右，Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60–68℃，内部引物组3’端20个碱基左右的Tm值在55–63℃，内部引物组5’端和3’端之间为转录位点，要根据引物自身二级结构微调转录区5’序列和3’序列，使得引物二级结构最小，整个内部引物组碱基长度在50–70之间。环引物组的Tm值在60–66℃，碱基长度15–25个。所有引物的GC含量控制在30％-65％，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160-220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120–本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如下的引物，/n上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO: 1所示，/n下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:2所示，/n上游内部引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示，/n下游内部引物BIP，其序列如SEQ ID NO: 4所示，/n环引物LF，其序列如SEQ ID NO: 5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如下的引物，
上游外部引物F3，其序列如SEQIDNO:1所示，
下游外部引物B3，其序列如SEQIDN0:2所示，
上游内部引物FIP，其序列如SEQIDN0:3所示，
下游内部引物BIP，其序列如SEQIDNO:4所示，
环引物LF，其序列如SEQIDNO:5所示。


2.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括环介导等温扩增反应试剂和荧光染料。


3.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括流感嗜血杆菌阳性质控标准品。


4.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括作为阴性对照的无核糖核酸酶的去离子水。


5.如权利要求2所述的环介导等温扩增检测流感嗜血杆菌的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：范列英，司玉莹，李根，陆柳，张雯雁，叶扬琴，
申请(专利权)人：上海市东方医院同济大学附属东方医院，
类型：发明
国别省市：上海;31