特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用制造技术

本发明专利技术公开一种特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成。通过设计尖孢镰刀菌的特异性ITS序列的LAMP引物、CYP序列的LAMP引物、IGS序列的LAMP引物等技术手段，最终选择IGS序列设计鉴定草莓尖孢镰刀菌的LAMP引物；同时利用炭疽菌属菌种ITS后半部分与其它属同源性极低的特性，设计ITS序列的LAMP特异引物，同时加入ITS引物和IGS引物，利用LAMP技术首次同时快速准确的将草莓中的尖孢镰刀菌和炭疽菌分辨检测，不仅检测灵敏度较PCR技术提高了1000倍，价格低、检测时间短、方法简单，对于草莓病原菌实时监测和前期预警具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用
本专利技术属于生物
，具体的，本专利技术涉及基于一种特有靶标引物在同时快速检测草莓尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌中应用的

技术介绍
草莓(FragariaananassaDuch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物，果肉鲜美多汁，堪称“水果皇后”。近年来，草莓种植面积逐年增大，品种不断更新，频繁地调种、引种以及连作，其中草莓枯萎病和炭疽病为两种最常见也是目前最主要的病害。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌从根部侵染引起的系统性病害，从苗期到收获期都会发生。草莓感染草莓枯萎病后，地上部分表现为心叶变黄绿、卷曲呈船形、两边不对称，叶片无光泽，叶柄及根部维管束变褐色或黑褐色，地下根系黑褐色，不长新根。该病可导致草莓结果减少、果实无法正常膨大、品质降低，甚至全株枯死。草莓炭疽病主要为害草莓的匍匐茎与叶片，严重时病菌侵入短缩茎，致使整株凋萎枯死；叶片、托叶、花及果实也可感染。以上两种病害症状一旦发现，对农业生产造成巨大危害，并且病害流行速度快，造成的经济损失非常严重，国外对草莓炭疽病目前被普遍认可的是由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)、草莓炭疽菌(C.fragariae)以及其它炭疽菌病引起了草莓炭疽病。鉴于草莓病害为害的严重性，因此，明确每种病害的病原菌种类对于控制病害的发生尤为重要。目前没有杀菌剂可以安全、有效而又经济地控制这两种病害。因此，亟需一种能够在发病初期或者土壤中进行早期快速检测鉴别的技术，以便及时采用有针对性的有效防治措施来控制病害的发生和传播。传统的病原菌检测技术、免疫学检测技术已经很难明确地鉴定病原菌且耗时长、灵敏度低，而目前大多数分子生物学检测技术费时、费力、准确性低，且不能在病害潜伏期和初期作出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本的荣研株式会专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。国内外对此技术在草莓病毒病的检测中的应用，对草莓炭疽菌限于单个菌种的检测，缺少对炭疽属的LAMP检测，且多为单一LAMP检测，目前还没有利用LAMP检测同时检测草莓尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的报道。
技术实现思路
目前，针对大部分真菌rDNA-ITS序列相似性较高，仅以ITS区作为靶序列，不能有效地进行检测的技术现状，且现有技术中未见有文献记载和披露利用LAMP技术同时快速鉴定出草莓感染的尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的技术现状。本专利技术旨在于提供特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，通过设计尖孢镰刀菌的特异性ITS序列的LAMP引物、CYP序列的LAMP引物、IGS序列的LAMP引物等技术手段，最终选择IGS序列设计鉴定草莓尖孢镰刀菌的LAMP引物，同时利用炭疽菌属菌种ITS后半部分与其它属同源性极低的特性，设计ITS序列的LAMP特异引物，快速准确的将草莓中尖孢镰刀菌和炭疽菌分辨检测，具有广泛的应用推广价值。为了达到以上技术目的，本专利技术采用的技术方案：本专利技术具体提供特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成。草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP检测由5条特异引物FIP、BIP、F3、B3和Loop组成；草莓炭疽菌ITS基因LAMP分子检测的6条特异性引物FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB组成。进一步，本专利技术提供一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的LAMP检测试剂盒，所述检测试剂盒包括1.0μL的BstDNA聚合酶(8U)，2.5μL的10×BstReactionBuffer，4μL的0.8mol/L甜菜碱，3.5μL的1.4mmol/LdNTPs，4μL的8mmol/LMgSO4，尖孢镰刀菌LAMP引物20μmol/L的F3及B3引物各0.25μL，40μmol/L的FIP和BIP引物各1μL，40μmol/L环引物Loop0.5μL；炭疽菌LAMP引物10μmol/L的F3及B3引物各0.25μL，20μmol/L的FIP和BIP引物各1μL，10μmol/L环引物Loop各1μL，1μLDNA模板(10ng/μL)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μL。具体的，本专利技术提供一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的LAMP检测试剂盒的应用，具体的应用技术方案包括如下步骤：(1)引物设计与合成根据GenBank中已知的草莓尖孢镰刀菌IGS基因，炭疽菌属ITS基因后半部分区域作为靶序列，与镰刀菌属ITS区域非重复序列，采用在线的PrimerExplorerVer.5引物设计软件设计两组特异LAMP引物：特异性检测草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP引物序列为：FIP:GCAACCTGGCGAGGACGAAACACTGTCGAAACGAGATGCGBIP:AATTCGAGTTTCGTCGCCGACAGCCGGAGAGAGATTTGCCTAF3:GCGGAATGGGAAGTCGATTCB3:TCACGACCACCAGACAAGTLoop:GTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTA特异性检测炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列为：FIP:CTACGCAAAGGAGGCTCCGGGGGCCCTACAGCTGATGTBIP:TTACGTCTCGCACTGGGATCCGTCCGAGGTCAACCTTTGGAAF3:TCAAGCTCTGCTTGGTGTTGB3:GTTCAGCGGGTATTCCTACCLoopF:GCCACTACCTTTGAGGGCCLoopB:GAGGGACTCTTGCCGTAAAA(2)DNA模板获取：取待检病样的茎基部，用水冲洗干净，取病样组织、含有病原菌土壤或者将发病组织分离到的病原菌菌丝2mg放入灭菌离心管中，加入DNA样品处理液50μL，80℃反应5min，得到含有病原菌DNA的待检病样品悬浮液，采用快速提取法提取DNA。(3)配制单一LAMP反应体系：LAMP反应体系各组分含量为，总体系25μL，包括1.0μL的BstDNA聚合酶(8U)，2.5μL的10×BstReactionBuffer，4μL的0.8mol/L甜菜碱，3.5μL的1.4mmol/LdNTPs，4μL的8mmol/LMgSO4，20μmol/L的F3及B3引物各0.25μL，40μmol/L的FIP和BIP引物各1μL，40μmol/L环引物Loop0.5μL，1μLDNA模板(10ng/μL),加双蒸水使反应体系总体积达到25μL。(4)配制双重LAMP反应体系：LAMP反应体系各组分含量为，总体系2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，其特征在于，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成；草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP分子检测由5条特异引物FIP、BIP、F3、B3和Loop组成；草莓炭疽菌ITS基因LAMP分子检测由6条特异性引物FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB组成，通过草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，其特征在于，特有靶标引物由草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成；草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP分子检测由5条特异引物FIP、BIP、F3、B3和Loop组成；草莓炭疽菌ITS基因LAMP分子检测由6条特异性引物FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB组成，通过草莓尖孢镰刀菌IGS基因和草莓炭疽菌ITS基因的LAMP引物序列组成特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用。


2.如权利要求1所述的特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，其特征在于，草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP检测由5条特异引物FIP、BIP、F3、B3和Loop序列具体如SEQIDNO.1-5所示。


3.如权利要求1所述的特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，其特征在于，草莓炭疽菌ITS基因LAMP分子检测的6条特异性引物FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB序列具体如SEQIDNO.6-11所示。


4.一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括1.0μL的BstDNA聚合酶(8U)，2.5μL的10×BstReactionBuffer，4μL的0.8mol/L甜菜碱，3.5μL的1.4mmol/LdNTPs，4μL的8mmol/LMgSO4，尖孢镰刀菌LAMP引物20μmol/L的F3及B3引物各0.25μL，40μmol/L的FIP和BIP引物各1μL，40μmol/L环引物Loop0.5μL；炭疽菌LAMP引物10μmol/L的F3及B3引物各0.25μL，20μmol/L的FIP和BIP引物各1μL，10μmol/L环引物Loop各1μL，1μLDNA模板(10ng/μL)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μL。


5.一种同时快速鉴定草莓感染尖孢镰刀菌和炭疽菌两种病原菌的LAMP检测试剂盒的应用，其特征在于，具体的应用技术方案包括如下步骤：
(1)引物设计与合成
根据GenBank中已知的草莓尖孢镰刀菌IGS基因，炭疽菌属ITS基因后半部分区域作为靶序列，与镰刀菌属ITS区域非重复序列，采用在线的类似PrimerExplorerVer.5引物设计软件设计两组特异LAMP引物：
特异性检测草莓尖孢镰刀菌IGS基因的LAMP引物序列为：
FIP:GCAACCTGGCGAGGACGAAACACTGTCGAAACGAGATGCG
BIP:AATTCGAGTTTCGTCGCCGACAGCCGGAGAGAGATTTGCCTA
F3:GCGGAATGGGAAGTCGATTC
B3:TCACGACCACCAGACAAGT
Lo...

【专利技术属性】
技术研发人员：史芳芳，王雷，张延磊，梁武军，陈烨华，
申请(专利权)人：新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：新疆;65