一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP‑seq方法，包括对禾谷镰刀菌组织进行甲醛交联反应、细胞裂解获取细胞核沉淀、超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段、使用标签抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应、洗脱并纯化与目的蛋白结合的DNA及建库测序六个步骤。本发明专利技术主要通过改良优化禾谷镰刀菌组织的染色质提取及超声破碎方法，更高效率获得具有完整天然结构的蛋白，从而得到真实抗体吸附的DNA‑蛋白复合物；且得到的蛋白核酸复合物的小片段可直接用于后续免疫共沉淀反应，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况；并进一步用富集后得到的DNA建库后二代测序，应用于禾谷镰刀菌组织DNA生物信息学分析。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法。
技术介绍
随着表观遗传学研究的深入，其已成为当今生物学领域的研究热点。染色质免疫共沉淀结合高通量测序技术(ChromatinImmunoprecipitationwithhighthroughputsequencing，ChIP-seq)是一种解码转录调控网络的强大方法。为了维持体内平衡，生物体通常需要响应环境变化而调整基因表达。这些调整通常是由转录因子控制的，它们可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，体内研究转录因子活性和范围的传统生物学技术较为困难，所以，对转录因子在微生物中的结合位点的认识还很有限。染色质免疫共沉淀与高通量测序分析相结合的方法为快速确定基因组水平调节子打开了大门，可以研究整个基因组的转录因子结合位点(Giner-LamiaJetal2018)。禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)复合种群引起的小麦赤霉病近年来在我国呈加重发生趋势，病害流行不仅直接造成严重的产量损失，病菌还会产生真菌毒素，导致小麦质量下降，甚至失去食用或饲用价值。了解禾谷镰刀菌生长发育及致病分子机制是有效控制该病害的重要前提，通过ChIP-seq技术对禾谷镰刀菌的某些致病因子进行研究，可以揭示它们在禾谷镰刀菌生长发育及致病过程中的分子机制(ChenYunetal2018)。目前，ChIP技术研究的主要材料集中在细胞或组织样本，处理方法已经较为成熟，但对具有细胞壁结构的真菌效果并不是很好。由于使用真菌菌体进行ChIP试验研究的相关报道较少，且真菌材料的前期处理要求高、破碎难度大，使得难以从真菌菌体中得到高质量的DNA-蛋白复合物，这些因素制约着该项技术在真菌中的应用。因此，专利技术一种能够在真菌中开展的ChIP-seq方法变得至关重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，该方法处理禾谷镰刀菌菌体后能得到合适大小的DNA-蛋白质片段能方便后续的抗体免疫共沉淀实验，并且所有实验操作均保持低温条件，更大程度保证了蛋白结构的稳定。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，包括如下步骤：S1、对禾谷镰刀菌组织进行甲醛交联反应；S2、细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解获取细胞核沉淀；S3、超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段：S4、使用标签抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；S5、洗脱并纯化与目的蛋白结合的DNA；S6、建库测序；其中，步骤S2中，在用细胞裂解液进行裂解前，将甲醛交联的菌体放置干冰上预冷10min，用液氮碾磨样品；然后用细胞裂解液对碾磨后样品裂解45min，再用核裂解液裂解20min。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，所述细胞裂解液含10mMHEPES、80mMKCl、1％(v/v)IGEPALCA-630和蛋白酶抑制剂。进一步，优选的，所述细胞裂解液的添加量为每0.5g禾谷镰刀菌组织加入10mL细胞裂解液。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，所述核裂解液含50mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、1.5％(v/v)SDS和蛋白酶抑制剂。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中，所述超声条件为每次超声30s，间隔30s，超声循环10次。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S4具体包括如下步骤：S4-1、用ChIPdilutionbuffer洗proteinG磁珠3次，加入990μLChIPdilutionbuffer和5μL标签抗体4℃静音混匀器上过夜孵育；S4-2、再用ChIPdilutionbuffer清洗磁珠3次，最后再加入900μLChIPdilutionbuffer及100μL染色质溶液，4℃静音混匀器上孵育7-12h。进一步，优选的，所述ChIPdilutionbuffer含1.1％(v/v)TritonX-100、1.2mMEDTA，16.7mMTris-HCl(pH8.0)和167mMNaCl。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5具体包括如下步骤：S5-1、将装有反应后磁珠的离心管置于磁力架上，弃上清，依次加入Lowsaltwashbuffer、Highsaltwashbuffer、LiClwashbuffer和TEbuffer进行洗涤；S5-2、弃上清，加入260μLElutionbuffer后65℃、800rpm离心20min，磁力架上放置2min，吸上清于一新的离心管中；S5-3、重复步骤S5-2，两次Elutionbuffer洗脱后的上清共500μL；S5-4、加入20μL5MNaCl后65℃、600rpm过夜解交联，取15μLInput加入500μLElutionbuffer和20μL5MNaCl同时解交联；S5-5、向解交联产物中加入10μL0.5MEDTA、5μLRNase及20μLTris-HCl(pH7.0)于恒温振荡仪上37℃、600rpm孵育30min，之后加入2μL蛋白酶K，55℃、600rpm孵育1h，纯化解交联产物。进一步，优选的，所述Lowsaltwashbuffer含150mMNaCl、0.1％(v/v)SDS、1％(v/v)TritonX-100、2mMEDTA和20mMTris-HCl(pH8.0)；所述Highsaltwashbuffer含500mMNaCl、0.1％(v/v)SDS、1％(v/v)TritonX-100、2mMEDTA和20mMTris-HCl(pH8.0)；所述LiClwashbuffer含0.25MLiCl、1％(v/v)NP-40、1％(w/v)脱氧胆酸钠、1mMEDTA和10mMTris-HCl(pH8.0)；所述TEbuffer含100mMTris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA。进一步，优选的，所述Elutionbuffer含1％(v/v)SDS和0.1MNaHCO3。本专利技术的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术方法能够在真菌中完成ChIP-seq，通过提取真菌染色质，对真菌中感兴趣的蛋白进行免疫共沉淀，实现真菌体内DNA和蛋白的相互作用研究；(2)真菌具有细胞壁结构，较为温和的直接裂解方式较难获得高质量的细胞核，本专利技术通过液氮研磨的方式可以破坏真菌的细胞壁结构，细胞裂解液中的IGEPALCA-630作为非离子去垢剂，有利于高效裂解细胞，同时，核裂解液中高浓度的SDS可以促使细胞核释放，从而提取出高质量的染色质；(3)本专利技术方法在真菌中的稳定性好、适用性广。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、对禾谷镰刀菌组织进行甲醛交联反应；/nS2、细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解获取细胞核沉淀；/nS3、超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段：/nS4、使用标签抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；/nS5、洗脱并纯化与目的蛋白结合的DNA；/nS6、建库测序；/n其中，步骤S2中，在用细胞裂解液进行裂解前，将甲醛交联的菌体放置干冰上预冷10min，用液氮碾磨样品；然后用细胞裂解液对碾磨后样品裂解45min，再用核裂解液裂解20min。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对禾谷镰刀菌组织进行甲醛交联反应；
S2、细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解获取细胞核沉淀；
S3、超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段：
S4、使用标签抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；
S5、洗脱并纯化与目的蛋白结合的DNA；
S6、建库测序；
其中，步骤S2中，在用细胞裂解液进行裂解前，将甲醛交联的菌体放置干冰上预冷10min，用液氮碾磨样品；然后用细胞裂解液对碾磨后样品裂解45min，再用核裂解液裂解20min。


2.如权利要求1所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于：步骤S2中，所述细胞裂解液含10mMHEPES、80mMKCl、1％(v/v)IGEPALCA-630和蛋白酶抑制剂。


3.如权利要求2所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于：所述细胞裂解液的添加量为每0.5g禾谷镰刀菌组织加入10mL细胞裂解液。


4.如权利要求1所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于：步骤S2中，所述核裂解液含50mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、1.5％(v/v)SDS和蛋白酶抑制剂。


5.如权利要求1所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于：步骤S3中，所述超声条件为每次超声30s，间隔30s，超声循环10次。


6.如权利要求1所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于，步骤S4具体包括如下步骤：
S4-1、用ChIPdilutionbuffer洗proteinG磁珠3次，加入990μLChIPdilutionbuffer和5μL标签抗体4℃静音混匀器上过夜孵育；
S4-2、再用ChIPdilutionbuffer清洗磁珠3次，最后再加入900μLChIPdilutionbuffer及100μL染色质溶液，4℃静音混匀器上孵育7-12h。


7.如权利要求6所述的适用于禾谷镰刀菌的ChIP-seq方法，其特征在于：所述ChIPdilutionbuffer含1....

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽卿，
申请(专利权)人：武汉爱基百客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42