果生炭疽菌特异性基因序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了果生炭疽菌特异性基因序列及其应用。本发明专利技术基于果生炭疽菌及其近缘物种的全基因组比对获得果生炭疽菌特异性基因序列，进一步利用特异性基因序列设计PCR扩增引物对果生炭疽菌进行检测，并开发相关试剂盒。本发明专利技术可特异检测果生炭疽菌(C.fructicola)，将其与隐秘炭疽菌(C.aenigma)、暹罗炭疽菌(C.siamense)、香蕉炭疽菌(C.musae)等近缘物种区分；具有快速、简便、准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
果生炭疽菌特异性基因序列及其应用
本专利技术涉及植物病原生物检测技术，特别涉及一种果生炭疽菌特异性基因序列及其应用。
技术介绍
果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)是属于胶孢炭疽复合群下的一个病原种，在全球广泛分布，能侵染危害牛油果、可可、芒果、梨、苹果、草莓、茶、烟草等几十种植物，是非常重要的一类植物病原菌。果生炭疽菌也能作为内生菌与植物共生，不引起明显的病害症状。目前，果生炭疽菌的物种鉴定严格依赖于多基因系统发育，需要扩增获得核糖体DNA基因转录间隔区(intergenicspacerregion,ITS)、肌动蛋白(Actin)、β-微管蛋白(β-Tubulin)、甘油三磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GADPH)、钙调蛋白(Calmodium,CAL)、几丁质合成酶(Chitinsynthase,CHS-1)、谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase,GS)、超氧化物歧化酶2(Manganese-superoxidedismutase,SOD2)等多个基因的DNA序列。果生炭疽菌的近缘物种数量较多，这些近缘物种间亲缘关系较近且形态特征差异不明显。多基因系统发育分析是目前鉴定果生炭疽菌物种的唯一手段。运用该技术进行物种鉴定，需要对待检菌株的6-7个靶基因进行PCR扩增，再对获得的目标DNA片段进行测序，然后与公共数据库参比菌株进行序列比对，最后构建系统发育树并进行结果判定。该技术手段虽然结果可靠，但步骤繁琐，费时费力，且对仪器设备和分析人员的专业背景要求较高。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的目的是提供一种果生炭疽菌特异性基因序列。为此，本专利技术所提供的序列为SEQIDNo.1所示序列。该序列特异存在于果生炭疽菌株基因组，且在菌株间高度保守，但不存在于隐秘炭疽菌(C.aenigma)、暹罗炭疽菌(C.siamense)等邻近物种的基因组。进一步，本专利技术还提供了根据上述基因序列设计的PCR扩增引物。具体的，包括引物P1-F和引物P1-R，所述引物P1-F的序列如SEQIDNo.2所示，所述引物P1-R的序列如SEQIDNo.3所示。同时，本专利技术还提供了上述引物检测果生炭疽菌的应用。具体的，所述应用方法包括：(1)从待测菌株材料中提取基因组DNA；(2)以待测菌株的基因组DNA为模板，用引物P1-F和P1-R进行PCR扩增；(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据扩增结果判断菌株是否属于果生炭疽菌。更进一步，本专利技术提供了上述引物用于制备果生炭疽菌检测试剂盒的应用。另一方面，本专利技术又提供了一种果生炭疽菌检测试剂盒。为此，所提供的试剂盒包括PCR试剂和上述引物。相对于现有技术，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(1)本专利技术提供一个果生炭疽菌物种特有的核苷酸序列，可为开发适用于物种快速检测鉴定的PCR、LAMP分子标记和试剂盒提供重要便利；(2)本专利技术开发的PCR引物组适用于果生炭疽菌快速检测，特异性强，重复性好，有效弥补了炭疽形态鉴定方法准确性不足的缺点；(3)本专利技术鉴定步骤简单快速，成本低廉，无需对多个基因位点进行PCR扩增、测序和系统发育分析，利于推广；(4)本专利技术可应用于农业科研中的微生物种质资源鉴定、物种多样性研究、出入境检验检疫等方面，可为微生物种质资源保护，进境有害生物检测提供重要依据。附图说明图1为基因组比对鉴定到的果生炭疽菌物种特异区域；A图展示在该物种特异区域附近，以果生炭疽菌1104-7基因组为参照，其它菌株Illumina二代测序短序列(reads)的比对结果，果生炭疽物种特异区域以虚线标注，蓝色道(1)，1104-7菌株；绿色道(2-17)，其它果生炭疽菌株；黄色道(18-25)，果生炭疽邻近物种菌株(18：隐秘炭疽；19-24：暹罗炭疽；25：胶孢炭疽)，红色道(26)，预测基因；B图展示果生炭疽菌株1104-7和隐秘炭疽菌株XY15在果生炭疽菌物种特异区域处的序列对位示意图。图2为PCR引物组P1-F和P1-R引物能特异检测果生炭疽菌；图示以果生炭疽菌(C.fructicola)、隐秘炭疽菌(C.aenigma)、香蕉炭疽菌(C.musae)、暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)等物种菌株基因组DNA为模板，用P1-F/P1-R引物组进行PCR扩增，扩增产物的PCR电泳结果；1-6：果生炭疽菌；7-9：隐秘炭疽菌；10-13：香蕉炭疽菌；14-16；暹罗炭疽菌；17：胶孢炭疽菌；18：阴性对照(NTC)。图3为果生炭疽菌快速检测鉴定试剂盒的准确性评估；图A展示基于PCR扩增对8株苹果炭疽病菌的筛选检测结果，Wq_01呈阳性反应，其余呈阴性反应；图B展示对8株菌的系统发育分析，Wq_01鉴定为果生炭疽，其余7株菌分别鉴定为隐秘炭疽菌和暹罗炭疽菌。具体实施方式本专利技术提供一种基于果生炭疽菌特异序列的快速物种核酸检测方法。以下结合附图和实例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)。以下实施例所用序列或生物材料均来自公众可获取的渠道，如GenBank公共数据库、中国农业微生物菌种保藏管理中心、西北农林科技大学等。实施例1：本专利技术的果生炭疽菌物种特异性DNA序列长19878bp，其序列如SEQIDNo.1所示，其获取鉴定方法说明如下：(1)选取GenBank公共数据库中20余个子囊菌基因组，对其全基因组编码蛋白进行OrthoMCL聚类，从中筛选出果生炭疽物种特异的OrthoMCL聚类簇；(2)依托西北农林科技大学真菌研究室前期测序获得的胶孢炭疽组学资源(17个果生炭疽菌株基因组和8个果生炭疽菌近缘种基因组)，对获得的果生炭疽特异OrthoMCL聚类簇做tBlastn分析和基因组比对分析，验证基因的果生炭疽物种特异性和果生炭疽种内菌株间保守性；(3)在步骤(1)和(2)基因组比对基础上，进一步通过GenBank数据库的Blast比对和手动筛选，获得果生炭疽菌物种特异DNA，如图1所示，目标序列具有如下特征：(3.1)序列有高度的果生炭疽物种特异性；该序列仅存在于果生炭疽菌，而不存在于隐秘炭疽、暹罗炭疽、胶孢炭疽等果生炭疽菌的近缘种；另外，对GenBank公共数据库进行检索，果生炭疽种外亦未发现该序列；(3.2)序列在果生炭疽种内高度保守；分析17个果生炭疽菌株的基因组，发现所有菌株基因组均含有该序列，其DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果生炭疽菌特异性基因序列，其特征在于，所述序列为SEQ ID No.1所示序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种果生炭疽菌特异性基因序列，其特征在于，所述序列为SEQIDNo.1所示序列。


2.根据权利要求1所述基因序列设计的PCR扩增引物。


3.如权利要求2所述的PCR引物，其特征在于，包括引物P1-F和引物P1-R，所述引物P1-F的序列如SEQIDNo.2所示，所述引物P1-R的序列如SEQIDNo.3所示。


4.权利要求2或3所述引物检测果生炭疽菌的应用。


5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓飞，孟亚楠，郭云忠，朱明旗，孙广宇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61