【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cfdna末端修复及建库的方法。
技术介绍
1、血浆游离dna(circulating cell free dna,cfdna)是一种存在于血浆中的游离的、不与细胞核融合的dna片段。cfdna可以用于非侵入性的液体活检，用于癌症早期筛查、疾病监测和治疗效果评估。此外，cfdna也被用于产前诊断、器官移植监测等领域。目前研究学者发现血浆cfdna携带单链dna末端，即锯齿状末端。研究发现88％的血浆cfdna分子均携带锯齿状末端，cfdna锯齿状末端的产生与dna核酸酶活性有关。cfdna锯齿状末端代表了cfdna的固有特性，是疾病中一种新生物学标志物。
2、专利公告号为cn111378632b的文献提供了一种cfdna末端修复酶组合物，由酶ⅰ(taq dna聚合酶及klenow fragment，exo-)和酶ⅱ(t4polynucleotide kinase，简称t4pnk)组成，可以使cfdna在dntp存在下进行dna双链修复及3’端加a，并使cfdna 5’端发生磷酸化修饰。
3、但此种cfdna末端修复法并未保留cfdna锯齿状末端序列结构，导致这部分数据信息缺失。并且klenow fragment，exo-具有3’-5’外切酶活性和聚合酶活性，会导致cfdna在末端修复补平时会在3’端额外添加一个或多个核苷酸，进而引起信息分析差异。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种cfdna末端修复方法
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种保留cfdna锯齿状末端的末端修复方法，包括如下步骤：
3、s1.配置10×末端修复缓冲液试剂和末端修复酶组合试剂；
4、所述10×末端修复缓冲液试剂包含dmctp，所述末端修复酶组合试剂包含hemoklentaq和t4 polynucleotide kinase；
5、s2.配置末端修复反应体系，所述末端修复反应体系包含所述10×末端修复缓冲液试剂、所述末端修复酶组合试剂和cfdna，混匀再置于pcr仪上进行末端修复反应；
6、所述末端修复反应同时完成了三项操作：保留cfdna锯齿状末端序列的末端平齐化，在cfdna的3’端添加da，以及在cfdna的5’端修饰磷酸基团，从而获得具有粘性末端a且保留cfdna锯齿状末端序列的cfdna片段。
7、hemo klentaq是截短后的taq dna聚合酶，它缺失了n端的280个氨基酸。hemoklentaq还有其它突变，这些突变使它能够耐受全血中存在的抑制剂。此酶能够扩增人和小鼠全血样品中的dna而无需事先提纯。在大多数抗凝剂存在下hemo klentaq依然表现良好，包括肝素、柠檬酸和edta。
8、hemo klentaq不具有5’→3’外切酶活性和3’→5’外切酶活性，在保留cfdna锯齿状末端序列的基础上经过末端平齐化的cfdna 3’端添加碱基a，以获得具有粘性末端a的cfdna片段。本专利技术寻找到hemo klentaq，t4polynucleotide kinase二者同时具备活性的反应条件，即缓冲液条件和反应温度控制，可以将末端修复和加da在一步完成。
9、加入带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmctp)，代替普通胞嘧啶，与末端修复酶组合物处理cfdna以产生通过dmctp进行末端平齐化且3’端加a的cfdna，因此通过后续数据分析能够获得cfdna锯齿状末端序列的遗传信息。
10、优选地，所述hemo klentaq与所述t4 polynucleotide kinase的体积比为1:(0.1-1)。
11、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述dmctp浓度4-5mm。
12、优选地，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dgtp、dttp和datp，(dmctp+dgtp+dttp)和datp的摩尔比为(3-5)：(10-15)。
13、末端平齐化所需的四种脱氧核糖核苷三磷酸很少，末端平齐化后通过hemoklentaq为dna双链的3’端添加碱基a，所以反应体系中datp浓度对于cfdna 3’端加a效率影响较大。
14、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1m tris-hcl、0.1-0.2m mgcl2、0.01-0.15m dtt、0.1-0.2m kcl和10-30mmatp。
15、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述末端修复酶组合试剂包含：2-4μlhemo klentaq、1-2μl t4 polynucleotide kinase、90-100mm tris-hcl和体积浓度45-50％的甘油。
16、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述cfdna的加入量至少为1ng。
17、本专利技术优化了反应体系进行甲基化建库，使用先建库后转化的实验方案可以避免转化效率低下、文库污染等问题，提高建库效率和准确性。另外，仅需要1ng的cfdna就可以建立高质量的文库，可以在样本量极少的情况下进行研究，节省了实验成本和时间。
18、优选地，反应条件包括：所述末端修复反应体系ph值为7.0～8.5，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min。
19、本专利技术还提供了一种基于上述任一种cfdna末端修复方法的对血浆或精浆样本进行cfdna末端修复的应用。
20、在以上技术方案的基础上，本专利技术还提供一种cfdna建库方法，包括如下步骤：
21、步骤a.使用上述任一项所述的末端修复方法进行cfdna末端修复；
22、步骤b.在末端修复体系中直接加入illumina adaptor、t4 dna ligase及t4dnaligase buffer，进行接头连接；
23、步骤c.接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；
24、步骤d.进行cfdna甲基化处理，回收甲基化的cfdna；
25、步骤e.进行pcr扩增并将扩增产物纯化回收，得到cfdna测序文库。
26、因需要通过dmctp进行末端修复，以保证对cfdna锯齿状末端序列进行保留，因此，需要先进行末端修复与接头连接，再进行甲基化转化实验，所以需要在末端修复后，通过不受甲基化转化影响的接头进行接头连接。并且在末端修复后，无需将产物纯化就可以进行接头连接，减少产物损失。
【技术保护点】
1.一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：所述Hemo KlenTaq与所述T4 Polynucleotide Kinase的体积比为1:(0.1-1)。
3.如权利要求1所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述dmCTP浓度4-5mM。
4.如权利要求3所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dGTP、dTTP和dATP，(dmCTP+dGTP+dTTP)和dATP的摩尔比为(3-5):(10-15)。
5.如权利要求4所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1M Tris-HCl、0.1-0.2M MgCl2、0.01-0.15M DTT、0.1-0.2M KCl和10-30mM ATP。
6.如权利要求2所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端
7.如权利要求4所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：每50μL所述末端修复反应体系中，所述cfDNA的加入量至少为1ng。
8.如权利要求5所述的一种cfDNA末端修复方法，其特征在于：反应条件包括：所述末端修复反应体系pH值为7.0～8.5，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min。
9.如权利要求1-8中任一项所述的cfDNA末端修复方法在对血浆或精浆样本进行cfDNA末端修复的应用。
10.一种cfDNA建库方法，其特征在于：包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种cfdna末端修复方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种cfdna末端修复方法，其特征在于：所述hemo klentaq与所述t4 polynucleotide kinase的体积比为1:(0.1-1)。
3.如权利要求1所述的一种cfdna末端修复方法，其特征在于：每50μl所述末端修复反应体系中，所述dmctp浓度4-5mm。
4.如权利要求3所述的一种cfdna末端修复方法，其特征在于：所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dgtp、dttp和datp，(dmctp+dgtp+dttp)和datp的摩尔比为(3-5):(10-15)。
5.如权利要求4所述的一种cfdna末端修复方法，其特征在于：每50μl所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1m tris-hcl、0.1-0.2m mgcl2、0.01-0.15m dtt、0.1-0.2m kcl和10-30mm atp...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵传森，李泽卿，刘梦佳，安超群，
申请(专利权)人：武汉爱基百客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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