一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法及引物技术

本发明专利技术提出了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法及引物，使用猪组织样本通过ChIP‑seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定，其中，定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，对结果进行判定为，阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为富集效果达标，阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为富集效果未达标；能够特异性的检测猪组蛋白修饰水平，并能够有效的判定DNA区域富集效果，从而为ChIP‑seq提供重要参考，大大节省了由于富集效果差造成测序结果差所带来的时间和经济成本，为开展猪的表观基因组学研究提供有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法及引物
本专利技术涉及ChIP-seq
，尤其涉及一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法及引物。
技术介绍
脂肪沉积和肌肉生长是猪的最重要的经济性状之一，其直接影响猪肉品质的优劣及其经济价值的高低。因此，通过遗传学研究猪脂肪和肌肉组织的遗传性状是一门十分重要的课题。其中，表观遗传学研究是继遗传学后新兴发展起来的科学领域，是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的可遗传表达。组蛋白修饰则是表观遗传调控一个重要的调控方式，它可通过甲基化、乙酰化修饰等方式来调控基因的表达。而H3K4ME3和H3K27ac是组蛋白修饰的重要表观遗传修饰，已经在酵母菌、果蝇、人细胞和小鼠细胞都有表达并参与调控基因的转录。但在猪脂肪沉积和肌肉生长的机制还很模糊。技术人员通过对不同组蛋白修饰在猪脂肪和肌肉组织变化进行研究，探索在猪不同组织中的表达模式，再以此为参照，来寻找特异性调控脂肪沉积和肌肉生长的基因，其应用在畜牧业上，可以促进猪的遗传改良，而在医学上能够更好的解释代谢综合征的发病机制，有助于寻求更有效的防治措施，服务于农业生产以及医学临床等实际应用提供参考。目前，组蛋白修饰调控图谱研究中最重要的技术手段为染色质免疫共沉淀与二代测序技术结合起来的测序技术，即ChIP-Seq技术。这种技术首先利用特定组蛋白修饰抗体将此类组蛋白修饰结合的DNA区域富集，纯化建库后对此区域进行高通量测序。此技术被认为是全基因组范围内研究组蛋白修饰最好的方法。但是，ChIP技术研究的主要材料集中在模式动物的细胞或组织样本，处理方法已经较为成熟，但在猪肌肉和脂肪组织的应用较少，特别是脂肪组织对前期处理要求高、破碎难度大、提取完整细胞核较困难、材料间的稳定性不是很好，这些因素制约着该项技术在猪组织中的应用。特别是ChIP-seq成本较高，如果不在之前做好有效质控，在大规模样本富集后通过测序结果看实验的成败将会带来很大的损失。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法及引物。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；其中，定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，ΔCt[normalized样品沉淀]＝Ct[样品沉淀]-(Ct[Input]-Log2(InputDilutionFactor))，InputDilutionFactor(IDF)＝(fractionoftheinputchromatinsaved)-1；然后，计算阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数，其公式为，ΔΔCt[ChIP阳性引物/ChIP阴性引物]＝阳性引物ΔCt[normalized样品沉淀]-阴性引物ΔCt[normalized样品沉淀]，FoldEnrichment＝2^(-ΔΔCt[ChIP阳性引物/ChIP阴性引物])；最后，对结果进行判定为，阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为成功阳性沉淀富集，富集效果达标；阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为成功阴性沉淀富集，富集效果未达标。在以上技术方案的基础上，优选的，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA时，包括以下步骤，S1对猪组织样本进行甲醛交联反应，然后进行甘氨酸冰上终止交联，再离心获得沉淀，并用PBS对沉淀进行清洗；S2获得的组织细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解以获取细胞核沉淀；S3超声打断染色质以获得蛋白核酸复合物的小片段：S4使用组蛋白修饰抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；S5洗脱并纯化富集的与目的蛋白结合的DNA。更进一步优选的，步骤S2中，细胞裂解液包括10mMHEPES、80mMKCl、1％(v/v)IGEPALCA-630和蛋白酶抑制剂。更进一步优选的，细胞裂解液的添加量为，每1g猪组织加入3mL细胞裂解液。更进一步优选的，步骤S2中，核裂解液包括50mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、1.5％(v/v)SDS和蛋白酶抑制剂。更进一步优选的，步骤S3中，超声条件为每次超声30s，间隔30s，超声循环10次。更进一步优选的，步骤S4包括如下步骤，S41用ChIPdilutionbuffer洗proteinG磁珠3次以活化磁珠，加入990μLChIPdilutionbuffer和5μL的H3K4Me3或H3K27AC抗体，在4℃条件下，置于静音混匀器上过夜孵育；S42用ChIPdilutionbuffer清洗磁珠3次，加入900μLChIPdilutionbuffer和100μL染色质溶液，在4℃条件下，置于静音混匀器上孵育7-12h。更进一步优选的，步骤S5包括如下步骤，S51将反应后的磁珠装入离心管并置于磁力架上，弃去上清液后，依次加入Lowsaltwashbuffer、Highsaltwashbuffer、LiClwashbuffer和TEbuffer进行洗涤；S52弃去上清液，加入250μLElutionbuffer后，在65℃条件下，以800rpm离心20min，置于磁力架上放置2min后，吸取上清移至新的离心管中；S53重复步骤S52，在两次Elutionbuffer洗脱后，获得上清液共500μL；S54加入20μL5MNaCl后，在65℃条件下，以600rpm过夜解交联，取15μLInput加入500μLElutionbuffer和20μL5MNaCl同时解交联；S55向解交联产物中加入10μL0.5MEDTA、5μLRNase和20μLTris-HCl(pH7.0)，置于恒温振荡仪上，在37℃条件下，以600rpm孵育30min，之后加入2μL蛋白酶K，在55℃条件下，以600rpm孵育1h，纯化解交联产物。在以上技术方案的基础上，优选的，采用荧光定量QPCR方法进行定量检测时，荧光定量在ABI7500仪器上进行，利用Takara试剂盒，反应体系20μL；其中，包括1.5μLChIP-DNA模板、10μLSYBRPremixExTaq、0.4μLROX和上下游引物各0.5μL，加入ddH2O补足至20μL；扩增程序为，95℃预变性30sec；95℃变性10sec，退火延伸30sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行一个循环，收集信号。另一方面，提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测引物，引物对选自序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.2所示的阳性引物对和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；/n其中，所述定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，/n首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，/nΔCt

【技术特征摘要】
1.一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；
其中，所述定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，
首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，
ΔCt[normalized样品沉淀]＝Ct[样品沉淀]-(Ct[Input]-Log2(InputDilutionFactor))，
InputDilutionFactor(IDF)＝(fractionoftheinputchromatinsaved)-1；
然后，计算阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数，其公式为，
ΔΔCt[ChIP阳性引物/ChIP阴性引物]＝阳性引物ΔCt[normalized样品沉淀]-阴性引物ΔCt[normalized样品沉淀]，
FoldEnrichment＝2^(-ΔΔCt[ChIP阳性引物/ChIP阴性引物])；
最后，对结果进行判定为，
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为成功阳性沉淀富集，富集效果达标；
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为成功阴性沉淀富集，富集效果未达标。


2.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA时，包括以下步骤，
S1对猪组织样本进行甲醛交联反应，然后进行甘氨酸冰上终止交联，再离心获得沉淀，并用PBS对沉淀进行清洗；
S2获得的组织细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解以获取细胞核沉淀；
S3超声打断染色质以获得蛋白核酸复合物的小片段：
S4使用组蛋白修饰抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；
S5洗脱并纯化富集的与目的蛋白结合的DNA。


3.根据权利要求2所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述细胞裂解液包括10mMHEPES、80mMKCl、1％(v/v)IGEPALCA-630和蛋白酶抑制剂。


4.根据权利要求2所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述细胞裂解液的添加量为，每1g猪组织加入3mL细胞裂解液。


5.根据权利要求2所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述核裂解液包括50mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、1.5％(v/v)SDS和蛋白酶抑制剂。


6.根据权利要求2所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽卿，刘梦佳，
申请(专利权)人：武汉爱基百客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42