罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种罗氏沼虾性别分子标记引物，所述引物包括引物对1，所述引物对1包括Contig‑1上游引物和Contig‑1下游引物，其中Contig‑1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig‑1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该引物能在分子水平上鉴别雌雄性罗氏沼虾。本发明专利技术还公开了一种快速鉴定罗氏沼虾性别试剂盒及方法，该方法试剂盒和方法耗时短，检测结果准确。本发明专利技术最后公开了上述引物、试剂盒以及方法在罗氏沼虾全雌性或全雄性育种方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用
本专利技术属于虾类性别鉴定技术，具体涉及罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用。
技术介绍
随着现代生物学技术的应用，已通过限制位点相关DNA(restrictionsiteassociatedDNA，RAD)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)和微卫星(microsatellite，SSR)等方法，开发出多种水产生物的性别特异标记，如尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)等，但是这些分子标记开发方法工作量大，耗费时间长，准确率较低。目前，通过高通量测序，然后比较雌雄性基因组差异的方法，为性别分子标记开发提供了一种新的高效手段，现已成功开发出乌鳢及大黄鱼性别特异分子标记。罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)，属于节肢动物门、甲壳纲、长臂虾科、沼虾属。生长在淡水或咸淡水中，分布于印度洋、太平洋热带及亚热带地区。其个体大，食性广，肉质鲜嫩，营养价值高，是世界上养殖产量较高的虾类品种之一。很多甲壳纲的物种表现出雌雄生长速度不一致的特点，罗氏沼虾的雄性比雌性的生长速度要快，在重量上也超过雌性。生产上将罗氏沼虾雌雄混养，雌虾在投苗2-3个月后，因为性成熟开始抱卵就不再长肉；而雄虾因为交配消耗掉营养，在生长速度和个体规格上也受到了限制。罗氏沼虾雌雄混养的形式制约了其生长，是总体产量低的主要原因。单一性别养殖方式是一种更高效的养殖方式，可以减少雌雄混养之间的能量消耗，也减少人力的分选的投入，可以获得大规格的商品虾，提高养殖的经济效益，是养殖业发展的趋势。因此，罗氏沼虾单一性别养殖方式的开展将提高其产量与品质，具有巨大的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种罗氏沼虾性别分子标记引物，该引物能在分子水平上鉴别雌雄性罗氏沼虾。本专利技术第二目的在于提供一种快速鉴定罗氏沼虾性别的方法，该方法耗时短，检测结果准确。罗氏沼虾的性别由染色体决定，雌性为异型染色体(ZW)，雄性为同型染色体(ZZ)。尽管以往的染色体核型分析并没有发现明显的性染色体，但本申请专利技术人通过对雌雄基因组测序分析，发现雌性基因组有许多特异DNA片段。迄今为止，国内外尚无能够成功鉴定罗氏沼虾遗传性别的分子标记的报道，因此，开发一种准确鉴定遗传性别的分子标记在罗氏沼虾单性育种中具有极大的生产应用价值。本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种罗氏沼虾雌性分子标记引物，所述引物为引物对1，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：Contig-1上游引物：5’-gctgctttgaagtttgctgcatg-3’；Contig-1下游引物：5’-tggttggtcagattgactctgta-3’。本专利技术还提供了一种用于罗氏沼虾性别鉴定的试剂盒，该试剂盒包括上述罗氏沼虾雌性分子标记引物。本专利技术的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用上述罗氏沼虾性别分子标记引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，包括以下步骤：(1)设计引物对1；(2)制备罗氏沼虾DNA样品；(3)以步骤(2)中的DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雌性罗氏沼虾，若电泳结果在378bp位置处显示不具有特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雄性罗氏沼虾。优选的，步骤(2)中罗氏沼虾DNA样品制备采用柱式离心法提取获得。优选的，步骤(3)中采用引物对1进行PCR扩增时，PCR反应体系包含罗氏沼虾DNA样品50ng，Contig-1上游引物和Contig-1下游引物各0.8μL，2×TaqMasterMix10μL，加水补足反应体系，总共20μL。优选的，步骤(3)中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。优选的，步骤(3)中进行电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。由于上述罗氏沼虾雌性分子标记引物可以在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，进而对罗氏沼虾雌性进行识别，因此，可以将上述罗氏沼虾雌性分子标记引物、上述试剂盒以及上述方法在罗氏沼虾全雌性或全雄性育种方面进行应用。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术基于雌雄罗氏沼虾的基因组高通量测序数据，利用基因组组装和比对等分析方法，快速、准确的筛选出罗氏沼虾雌雄性别分子标记，首次设计了鉴别罗氏沼虾性别的雌性分子标记引物，该引物可对罗氏沼虾的性别进行快速准确地鉴定；(2)本专利技术方法建立了一种利用罗氏沼虾性别分子标记引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，利用一对特异性引物对，完成一个PCR反应就可以鉴别罗氏沼虾性别，相较于传统通过测交实验来判别亲本的性别，耗时短，效率高，节约资源。附图说明图1为实施例1中雌性特有候选片段长度分布情况示意图；图2为实施例1中W染色体候选片段获取示意图；图3为实施例1中W染色体特有片段长度分布情况示意图；图4为实施例1中仅在雌性样本中检测到扩增片段，在雄性样本中未检测到扩增片段的1对引物的PCR产物电泳图图5为实施例2中引物Contig-1F/R的雌雄个体(48尾)检测PCR产物电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例详细说明本专利技术的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本专利技术的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1本实施例提供的罗氏沼虾雌性别分子标记引物，引物包括引物对1，引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。具体的，该引物从5’-3’的核苷酸序列如下：Contig-1上游引物：5’-gctgctttgaagtttgctgcatg-3’；Contig-1下游引物：5’-tggttggtcagattgactctgta-3’。本实施例中上述罗氏沼虾雌雄性别分子标记引物通过以下方式获得，其步骤包括：一、测序文库构建及重测序1.罗氏沼虾DNA样品制备：繁殖期间剪取罗氏沼虾雌性3尾和雄性26尾个体肌肉，依次按雌性F1-F3、雄性M1-M26编号，采用常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗氏沼虾性别分子标记引物，所述引物包括引物对1，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种罗氏沼虾性别分子标记引物，所述引物包括引物对1，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.一种罗氏沼虾性别鉴定试剂盒，其特征是包括权利要求1中的罗氏沼虾性别分子标记引物。


3.一种利用权利要求1所述引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)设计引物对1；
(2)制备罗氏沼虾DNA样品；
(3)以步骤(2)中的DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雌性罗氏沼虾，若电泳结果在378bp位置处显示不具有特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雄性罗氏沼虾。


4.根据权利要求3所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，黄逸卿，刘云，刘小燕，董安民，王振斌，
申请(专利权)人：湖南银鱼农业科技有限公司，中山大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43