一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用。特异性引物的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.2所示的序列。探针的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。采用引物和/或探针建立的快速检测欧洲樱桃实蝇的分子生物学检疫鉴定方法，具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用
本专利技术属于昆虫检疫鉴定
，尤其涉及一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用。
技术介绍
欧洲樱桃实蝇Rhagoletiscerasi(L.)隶属于双翅目Tephritidae，实蝇科Tephritidae，绕实蝇属Rhagoletis。绕实蝇属(非中国种)是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中规定的我国禁止进境的检疫性有害生物。欧洲樱桃实蝇主要分布在欧洲和亚洲等地区，其是一种高度毁灭性昆虫，严重危害欧洲、亚洲等地区的樱桃产业。在欧洲如不进行化学防治，其侵染率可高达100％，产量损失高达60％-100％。该实蝇寄主植物广泛，包括各种不同种类的李属植物(蔷薇科；酸樱桃，欧洲甜樱桃，黑樱桃，马哈利酸樱桃)，忍冬属植物(忍冬科；金银忍冬、新疆忍冬)和小檗属植物(刺檗)等。此外，针对欧洲樱桃实蝇的防除工作十分困难，人们至今未找到防治欧洲樱桃实蝇的有效办法。欧洲樱桃实蝇为《进口乌兹别克斯坦樱桃、乌拉圭柑橘和智利鳄梨植物检验检疫要求的公告》(2017年第55号)、《进口新西兰柿子和土耳其鲜食樱桃植物检验检疫要求》(2016年第51号)、《关于进口塔吉克斯坦樱桃植物检验检疫要求的公告》(2013年第79号)等文件规定需要关注的有害生物。2017年-2018年，广州机场、珠海口岸多次在旅客携带樱桃果实中截获该实蝇幼虫；乌鲁木齐口岸在吉尔吉斯斯坦进口樱桃中也截获该实蝇幼虫。2017年原国家质检总局发布《关于严防欧洲樱桃实蝇随旅客携带物非法进境的警示通报》(质检动警[2017]第038号)。此外，我国北方大部分地区均处于温带地区，与欧洲樱桃实蝇分布纬度一致，推测其在我国的适生区范围很广。另外，我国广泛种植樱桃、忍冬等欧洲樱桃实蝇的寄主植物，2016年我国已超过土耳其成为世界第一樱桃生产大国。忍冬属植物是我国重要的水土保持、园林绿化及药用栽培品种，种植面积巨大，经济价值较高。由此可见，该实蝇一旦传入我国，将对我国的樱桃产业和园林绿化等产业造成严重打击，并将严重影响我国水果的出口贸易，从而带来巨大经济损失。为保护我国农林业生产生态安全，有效防止该害虫的入侵定殖和传播，加强该害虫的快速检疫鉴定方法的研究具有重要意义。目前，针对欧洲樱桃实蝇的检疫鉴定，进出境口岸检验检疫部门仍主要依赖该实蝇成虫形态特征进行鉴定，对于幼虫等其他虫态的鉴定一直是一个难题。大多数情况下实蝇的幼虫是最主要的截获虫态，而大多数实蝇幼虫形态特征普遍较相似，很难通过形态特征进行幼虫种类的区分，因此口岸检验检疫部门一般采用分子生物学方法进行幼虫的鉴定。利用通用引物测序方法进行的幼虫鉴定步骤较复杂，需要时间也较长：(1)将截获的实蝇幼虫提取DNA；(2)提取的DNA用昆虫COI基因等的通用引物进行PCR检测；(3)PCR产物进行凝胶电泳检测是否得到目标条带；(4)检测获得目标条带后将PCR产物送测序公司测序，等待测序结果；(5)将测序结果在NCBI网站上进行Blast序列比对，分析序列比对结果后判定是否为欧洲樱桃实蝇。这一过程往往需要3-7天才能完成，无法满足日常口岸快速准确灵敏鉴定的工作需要。目前，针对欧洲樱桃实蝇的快速检疫鉴定方法还没有方法，也没有相应的国家标准、行业标准。因此，能够快速、准确的检测欧洲樱桃实蝇是一项急需解决的难题。
技术实现思路
鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用。采用引物和/或探针建立的快速检测欧洲樱桃实蝇的分子生物学检疫鉴定方法，具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物，引物的序列包括SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.2所示的序列。该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列包括SEQIDNO.1所示的序列，下游引物的序列包括SEQIDNO.2所示的序列。本专利技术的有益效果包括：采用上述引物建立的快速检测欧洲樱桃实蝇的分子生物学检疫鉴定方法，具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。优选的，上游引物的序列为SEQIDNO.1所示的序列，下游引物的序列为SEQIDNO.2所示的序列。专利技术人在引物设计时，选择包含欧洲樱桃实蝇特异性位点的区域设计引物，在包含特异性位点的区域范围内通过评估引物二聚体、发夹结构、错配引发效率、上下游引物退火温度等，找到能特异性扩增欧洲樱桃实蝇的引物对。同时为了提高特异性，尽量保证特异性位点位于引物3’端，提高退火温度。因此，需综合考虑上述所有因素，设计出满足所有条件的种特异性引物，并通过多次试验验证，意外的发现采用上述的引物具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。本专利技术提供一种鉴定欧洲樱桃实蝇的探针，探针的序列包括SEQIDNO.3所示的序列。优选的，探针的序列为SEQIDNO.3所示的序列。本专利技术的有益效果包括：上述探针可以用于樱桃实蝇的分子生物学检疫鉴定中，具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。专利技术人在探针序列设计时综合考虑所有因素，选择包含欧洲樱桃实蝇特异性位点的区域设计探针，在包含特异性位点的区域范围内通过评估探针本身的二聚体、发夹结构、错配引发效率等，同时结合特异性引物的特性，保证探针的退火温度高于引物退火温度，找到能特异性结合欧洲樱桃实蝇的探针。通过设计满足所有条件的种特异性探针以及经过实验的多次验证，意外的发现采用上述探针进行检测具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。进一步，探针还标记有荧光标记基团。例如，在探针的5′端和3′端分别标记有FAM(6-羧基荧光素)和BHQ1等基团，采用上述基团有利于提高灵敏度。本专利技术提供上述的引物和/或探针在鉴定欧洲樱桃实蝇中的应用。本专利技术提供一种鉴定欧洲樱桃实蝇的方法，包括以下步骤：采用上述引物对待鉴定的样本的DNA进行PCR扩增。采用上述鉴定方法具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。具体的，PCR扩增的反应体系可以包括：10×PCR缓冲液2.5μL，50mmol/L氯化镁2.0μL，10mmol/LdNTP2.0μL，10μmol/L上游引物1.0μL，10μmol/L下游引物1.0μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，10-100ng/μL模板DNA1.0μL，ddH2O补至整个反应体系25μL。进一步，PCR扩增的反应条件可以包括：预变性：95℃3min；变性：95℃15s，退火：65℃1min，延伸：72℃30s，30个循环；延伸：72℃10min。采用上述PCR扩增的反应条件有利于欧洲樱桃实蝇特异性引物扩增，该退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本专利技术提供一种鉴定欧洲樱桃实蝇的方法，包括以下步骤：采用上述的引物和探针对待鉴定的样本的DNA进行荧光定量PCR扩增。具体的，荧光定量PCR扩增反应体系可以包括：2×Ta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物，其特征在于，引物的序列包括：SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.2所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物，其特征在于，引物的序列包括：SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.2所示的序列。


2.一种鉴定欧洲樱桃实蝇的探针，其特征在于，探针的序列包括SEQIDNO.3所示的序列。


3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，还标记有荧光标记基团。


4.权利要求1所述的引物和/或权利要求2或3所述探针在鉴定欧洲樱桃实蝇中的应用。


5.一种鉴定欧洲樱桃实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1所述引物对待鉴定的样本的DNA进行PCR扩增。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件包括：预变性：95℃3min；变性：95℃15s，退火：65℃1min，延伸：72℃30s，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玮琦，陈超，姜帆，李兰，耿俊东，郑敏，刘振伟，杨东来，王旭，
申请(专利权)人：满洲里海关技术中心，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15