一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，属于分子标记技术领域。本发明专利技术提供了用于罗氏沼虾遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，包括8对引物；本发明专利技术还提供了所述SSR分子标记引物组的获取方法；本发明专利技术还提供了所述SSR分子标记引物组在罗氏沼虾遗传多样性分析中的应用，所述引物组能有效对罗氏沼虾种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析。本发明专利技术所述的8对引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，丰富了罗氏沼虾种质资源遗传多样性分析的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用
本专利技术涉及SSR引物组领域，特别是涉及一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用。
技术介绍
罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii),又称大头虾、马来西亚大虾,隶属于节肢动物门,软甲纲,十足目,长臂虾科,沼虾属,原产于东南亚,是目前世界上重要的淡水养殖虾类之一,也是世界上最大的淡水虾。它在水生态系统中分布较广,在淡水区域(如江河、湖泊)和半咸水区域(如河口)均有分布,对水环境中的理化指标变化反应较敏感。它具有生长速度快、食性较广、生长周期短和抗病能力强等特点,自1976年该虾引入我国以来,已在浙江、江苏、上海、广东、广西、湖南、湖北等十多个省市自治区养殖推广。SSR(simplesequencerepeat,简单重复序列),由2-6个核苷酸为重复单元组成的DNA序列,同一类SSR可分布于基因组的不同位置上，由于其重复次数和重复程度不同而形成每个座位的多态性，在真核生物的基因组中分布广泛。这一序列具有共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖高等优点。因此，开发共显性的SSR分子标记引物用于罗氏沼虾的遗传多样性及品种鉴定保护等相关研究是十分必要的。目前，对于罗氏沼虾的SSR引物开发及相关遗传研究报道相对较少，极大的限制了罗氏沼虾的遗传多样性分析等相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQIDNo.1～16所示。进一步的，所述引物组通过以下步骤得到：(1)获取罗氏沼虾转录组序列，具体为：随机选择的罗氏沼虾3个健康个体的卵巢组织，提取RNA并等量混和；纯化并回收RNA；构建文库并测序；(2)使用MISAv1.0对步骤(1)获得的序列进行SSR位点的筛选；(3)罗氏沼虾转录组的设计：依据步骤(2)筛选的SSR位点，进行SSR引物设计，得到罗氏沼虾SSR标记引物组。进一步的，先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后再进行SSR位点的筛选；筛选标准包括以双核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于6次；以三核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以四核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于4次。本专利技术还提供了所述引物组合物在鉴评罗氏沼虾遗传多样性中的应用。进一步的，利用罗氏沼虾转录组鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，包括如下步骤：(1)取待分析罗氏沼虾的DNA；(2)将SEQNO.1～16所示引物组的5’端标记FAM；(3)以步骤(1)待测样品DNA为模板，利用步骤(2)所述5’端标记FAM后的SEQNO.1～16所示引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目，得到统计结果；(5)记录每对引物的扩增峰型，对获得的数据进行分析处理，评价罗氏沼虾种质的遗传多样性。进一步的，上述步骤(1)中提取分析罗氏沼虾的DNA时，以罗氏沼虾的腹部肌肉组织作为提取样本。进一步的，所述PCR的扩增体系为DNA模板1μl、上游引物0.1μl、下游引物0.3μl、2*GoldStarBestMasterMix5μl和水3.6μl。进一步的，所述PCR的扩增程序为95℃5min，95℃30s、45-60℃30s、72℃30s共15个循环，95℃30s、50℃30s、72℃30s共20个循环，72℃7min。本专利技术公开了以下技术效果：本方法利用转录组数据开发微卫星标记比较简单有效，并且转录组数据均来源于基因的转录区，可直接反应基因的表达信息。以期为罗氏沼虾种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建和分子标记辅助育种等提供更丰富的标记来源。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为DNA提取后的毛细管电泳检测结果；图2为不同类型重复基元SSR占总SSR的比例；图3为引物在3号样毛细管电泳检测结果；图4为引物在4号样毛细管电泳检测结果；图5为引物在5号样毛细管电泳检测结果；图6为引物在12号样毛细管电泳检测结果；图7为罗氏沼虾遗传多样性的UPGMA聚类树状图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1转录组测序随机选择的罗氏沼虾3个健康个体的卵巢组织，使用ReagentInvitrogen提取RNA。取等量RNA混和，构建基因组文库并测序，测序委托上海凌恩生物科技有限公司采用IlluminaHiSeq2500测序平台完成。表1罗氏沼虾转录组数据量统计实施例2SSR序列的筛选与鉴定使用MISAv1.0(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)对Unigene进行SSR检测，对应的各个Unitsize的最少重复数分别为以单核苷酸为重复单位时，其重复数至少为12次才可被检测到；以双核苷酸为重复单位时，其最少重复数为6；以三核苷酸为重复单位时，其重复数至少为5；以四核苷酸为重复单位时，其重复数至少为5；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4。最终对SSR出现频率、重复基元类型、重复次数及其多态性进行统计分析，结果见表2。表2罗氏沼虾转录组中不同SSR重复基元出现的频率由数据得，罗氏沼虾中共有48种重复基元。二、三、四、五、六碱基重复基元分别有4、10、19、7、6种。单核苷酸重复类型含量约占所有碱基重复类型的39.78％，比例最高，其中(A/T)n出现频率最高，占单核苷酸类型的97.91％；二碱基重复SSR含量约占总数的34.52％，其中出现的频率最多的是(AG/CT)n，占比约为51.38％；三碱基重复SSR占所有碱基重复类型的24.66％，四碱基重复SSR占比9.10％，五碱基、六碱基重复SSR所占比例较少。(AAT/ATT)n、(A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，其特征在于，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～16所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，其特征在于，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQIDNo.1～16所示。


2.一种权利要求1所述的引物组获取方法，其特征在于，所述引物组通过以下步骤得到：
(1)获取罗氏沼虾转录组序列，具体为：随机选择的罗氏沼虾健康个体的卵巢组织，提取RNA并等量混和；纯化并回收RNA；构建文库并测序；
(2)对步骤(1)获得的序列进行SSR位点的筛选；
(3)罗氏沼虾转录组的设计：依据步骤(2)筛选的SSR位点，进行SSR引物设计，得到罗氏沼虾SSR标记引物组。


3.根据权利要求2所述的引物组获取方法，其特征在于：先对步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后再进行SSR位点的筛选；筛选标准包括以双核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于6次；以三核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以四核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于4次。


4.一种权利要求1所述的引物组合物在鉴评罗氏沼虾遗传多样性中的应用。


5.一种鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

【专利技术属性】
技术研发人员：李喜莲，陈雪峰，顾志敏，高强，张宇飞，慎佩晶，徐洋，蒋文枰，徐宾朋，程海华，彭菲，黄振远，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33