一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。其鉴别方法首先采集待鉴别的河鲀样品，提取基因组DNA；然后以三种河鲀鱼基因组DNA为模板，用引物对其进行PCR扩增；最后对扩增产物进行电泳并根据条带差异进行鉴定。利用本发明专利技术的特异性引物鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法无需微卫星上机测序等复杂步骤，仅根据条带数量和位置即可快速准确的对三种鱼进行区分，具有稳定性好、实用性强、操作简单、准确率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法
本专利技术属于水产养殖
，具体涉及一种鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及方法。
技术介绍
暗纹东方鲀(Takifugufasciatus)和红鳍东方鲀(Takifugurubripes)俗称河鲀，隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)，辐鳍鱼亚纲(Actinopterygii)，鲀形目(Letrodontiforms)，鲀科(Tetraodontidae)，东方鲀属(Takifugu)，国内主要分布在中国黄海、渤海及近海海域、江海湖泊。二者肉质鲜嫩腴美，营养价值高，深受广大消费者喜爱，是具有较高经济价值的水产品。杂交育种通过将亲本基因型进行重新组合，使其后代可同时具有亲本的优良性状，甚至可能出现亲本不具备的一些形状特征，并具有一定的杂种优势。已报道的暗纹东方鲀雌鱼和红鳍东方鲀雄鱼杂交产生的杂交东方鲀，既具有暗纹东方鲀的丰富风味，又具有红鳍东方鲀生长快速的特性。尽管三种东方鲀在成鱼时期外观体型差异较明显，凭肉眼即可区分，但三种鱼在稚、幼鱼时期，外观体型十分相似，无法用肉眼区分。此外，对于部分河鲀组织或者加工的肉制品等难以从外观对其区分。随着近些年来河鲀养殖面临着种质混杂、品质退化严重、无序杂交等突出问题，因此，亟需一种物种鉴定方法对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀进行区分。物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上至关重要的研究步骤。因此，准确的对物种鉴定和分类就显得尤其重要。作为第二代分子标记，微卫星具有多态性、杂合率高、共显性遗传等特点。近年来，河鲀物种中微卫星标记的开发主要应用于分析河鲀不同地理群体间遗传多样性、近缘物种间种质进化及物种鉴定等方面。但目前为止，关于东方鲀属属间物种鉴别的报道并不多，关于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀鉴定的研究至今尚未见报道。传统利用微卫星标记技术鉴定物种的方法是在引物对的前引添加18bp特异荧光片段，并在PCR扩增体系中添加荧光试剂，对扩增后的PCR产物使用DNA测序仪ABI3730xl进行毛细管荧光电泳检测，根据等位基因峰值读取微卫星位点基因型，检测不同物种间基因型的差异或不同引物的多态性。操作繁琐、费时、成本较高。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种有效区分暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀种间鉴定的特异性引物；该引物组可快速、精准地对三种东方鲀进行鉴定。本专利技术还提供了所述的用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法。技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀[暗纹东方鲀(♀)×红鳍东方鲀(♂)，杂交东方鲀是由雌性暗纹东方鲀和雄性红鳍东方鲀杂交产生的杂交种]的特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示：正向引物SEQIDNO.1：5′-AAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；反向引物SEQIDNO.2：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。本专利技术所述用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀方法的试剂盒，其包括所述的特异性引物。本专利技术利用所述的特异性引物鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法，包括下列步骤：(1)提取待鉴定的东方鲀基因组DNA；(2)用所述的特异性引物对3种东方鲀DNA进行PCR扩增；(3)琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。其中，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为灭菌水7.4μL，2×TaqPlusMix10μL，10uM正反特异性引物各0.8μLDNA1μL。其中，步骤(2)所述PCR扩增反应程序为95℃预变性5min；40个循环：94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸7min，4℃保存。其中，步骤(3)PCR产物检测其中暗纹东方鲀有3条条带，位置分别在150bp、800bp和1500bp左右；红鳍东方鲀有3条条带，位置分别在150bp、1000bp和1800bp左右；杂交东方鲀有5条条带，位置分别处于150bp、800bp、1000bp、1500bp和1800bp左右。本专利技术通过对微卫星标记技术进行优化，不需添加荧光引物和荧光试剂，仅通过优化PCR扩增条件和电泳条件，即可通过电泳图谱对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交种进行鉴定，简单高效。本专利技术利用微卫星筛选软件MISA对暗纹东方鲀全基因组微卫星进行筛选并分析。随后根据全基因组中筛选出的大量微卫星位点结合脚本、引物软件进行批量开发引物，挑选出相关引物进行合成。提取暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀尾鳍DNA，以DNA为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳观察条带位置对3种河鲀加以区分。在实验过程中，专利技术人发现该微卫星引物特异性较低，不同的扩增条件(退火温度、延伸时间和循环次数)和琼脂糖浓度均对电泳结果有影响。本专利技术通过改变扩增条件和琼脂糖浓度，最终确定的扩增条件为最适条件。本专利技术通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，根据条带数目和位置对不同物种进行鉴定区分。简单、高效实现3种河鲀的物种鉴定，便捷、成本低。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术提供了一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的引物及方法，不受三种鱼个体年龄、性别、群体等限制，引物稳定性强、精准度高。(2)通过本专利技术设计的引物，本方法仅需PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测即可得到稳定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强。附图说明图1为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体中的扩增电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；图2为在不同地区暗纹东方鲀、野生红鳍东方鲀和养殖杂交东方鲀三个群体中的部分扩增电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；图3为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用特异性引物，通过改变PCR反应条件扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；图4为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用微卫星荧光引物扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；图5为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用微卫星荧光引物、微卫星扩增体系扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术基于SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的一对微卫星引物对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳结果分析，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示：/n正向引物SEQ ID NO.1：5′-AAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；/n反向引物SEQ ID NO.2：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示：
正向引物SEQIDNO.1：5′-AAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；
反向引物SEQIDNO.2：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。


2.一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀方法的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的特异性引物。


3.一种利用权利要求1所述的特异性引物鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法，其特征在于，包括提取待鉴定的东方鲀基因组DNA、利用特异性引物对东方鲀DNA进行PCR扩增以及PCR产物检测。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹绍武，徐杰杰，王涛，李杰，孙亦如，朱永祥，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32