免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒所述试剂盒包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品。本发明专利技术还公开一种免提取的检测CYP2C19基因多态性的检测方法。所述DNA聚合酶是本身或者经过基因工程改造后具有很强的抗PCR抑制剂的一种或几种DNA聚合酶。本发明专利技术的试剂盒及检测方法真正实现微量样本直接检测，免除外周血、拭子类样本的DNA提取环节。本发明专利技术中将微量的血液类样本、口腔拭子样本直接加入到PCR反应液中，运行PCR扩增程序即可完成CYP2C19基因多态性检测。整个检测过程不涉及有毒试剂，安全便捷，操作简易，整个检测耗时短，灵敏度高、特异性强、可以应用于高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测人基因组中是否存在CYP2C19基因多态性的免提取的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
人CYP2C19基因位于10号染色体上，长约90.21kb，含9个外显子和8个内含子。研究发现，CYP2C19基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢，如奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑，泮托拉唑(质子泵抑制剂)；氯吡格雷(血小板聚集抑制剂)；安定，氯巴占，苯妥英钠，苯巴比妥等(抗癫痫药)；氟西汀，西酞普兰，艾司西酞普兰，阿米替林，氯米帕明，丙咪嗪等(抗抑郁药)；地西泮、唑吡旦(镇静、安眠药)；环磷酰胺(抗肿瘤药)；氯胍(抗疟疾药)；伏立康唑(抗真菌药)；孕黄体酮等(激素)；普萘洛尔(心率不齐心绞痛药物)等。CYP2C19基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。CYP2C19酶活性存在多态性，因此不同的个体对药物代谢能力不同，产生的药物毒副作用及治疗效果不同。CYP2C19除了野生型等位基因CYP2C19*1外，存在CYP2C19*2～CYP2C19*21等多种突变等位基因，其中CYP2C19*2(外显子5的681位单个碱基突变G→A)和CYP2C19*3(外显子4的636位单个碱基突变G→A)为CYP2C19基因在亚洲人群中的主要突变类型，突变后造成相关药物代谢缓慢，CYP2C19*17为功能获得性等位基因，酶活性增强，代谢加快，在白种人以及美国黑人中的突变比例较高。CYP2C19*17有5′侧翼区-806C→T和-3402C→T2个突变位点，其中-806C→T起效应作用，因为含-806C→T的调控元件可结合肝核蛋白，可加快CYP2C19的转录速率，从而提高CYP2C19对奥美拉唑等药物的代谢效率。CYP2C19*17纯合子个体对奥美拉唑代谢快，且CYP2C19*17和CYP2C19*1纯合子个体之间对奥美拉唑的药物代谢动力学差异极显著，使得CYP2C19*17成为个性化用药的靶点。CYP2C19基因多态性的检测方法，主要是将待测样本经过核酸提取后再经PCR-RLFP法、直接测序法、固相/液相芯片法或ARMS-qPCR法进行检测。人基因组DNA提取方法，按照核酸释放原理可分为煮沸法、盐析法、碘化钾法、胍盐法等，按照核酸分离方式可以分为离心法、吸附法，按介质分有柱法和磁珠法。以上这些提取方法均需要借助专业的提取设备和耗材、提取试剂，操作人员需要熟练掌握提取操作技能。单个样本提取需要耗时0.5-1小时，加上核酸检测环节，从样本入检到得到检测结果通常需要耗时2-3小时，具体检测时长受制于样本量和提取的自动化程度。整个提取过程步骤较多，操作繁琐，一旦提取出现误操作，会导致整个实验的失败，在提取过程中也容易造成样本之间交叉污染，以及提取设备的污染。而且提取后需要进行专门的消毒清洁工作。另外，提取过程中操作人员需要接触有毒或者有腐蚀性的化学试剂，提取中会产生大量的废液，对人体以及环境都不够友好。市面上也有一些免提取的试剂，但仍需要样本的前处理步骤，需要借助核酸释放剂处理10-30分钟，再经离心才能用于下一步检测，并未实现真正的样本直接检测。以上这些方法都有着通量的限制，不能满足实际应用的需求。目前尚没有不用提取核酸就可以直接以荧光定量PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，该试剂盒能够对未经DNA提取的全血样本或口腔棉拭子样本直接进行检测，无需对样本进行DNA提取、借助核酸释放剂处理等操作。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，包括：2×PCR反应液、OligoMixA、OligoMixB、DNA聚合酶、阳性(PC)对照品和阴性(NC)对照品；其中，所述OligoMixA含有：rs4244285G型基因正向引物，序列如SEQIDNo.1所示；rs4244285G型基因反向引物，序列如SEQIDNo.3所示；rs4986893G型基因正向引物，序列如SEQIDNo.5所示；rs4986893G型基因反向引物，序列如SEQIDNo.7所示；rs12248560C型基因正向引物，序列如SEQIDNo.9所示；rs12248560C型基因反向引物，序列如SEQIDNo.11所示；Taqman探针，序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.8、SEQIDNo.12、SEQIDNo.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQIDNo.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQIDNo.14所示；所述OligoMixB含有：rs4244285A型基因正向引物，序列如SEQIDNo.2所示；rs4244285A型基因反向引物，序列如SEQIDNo.3所示；rs4986893A型基因正向引物，序列如SEQIDNo.6所示；rs4986893A型基因反向引物，序列如SEQIDNo.7所示；rs12248560T型基因正向引物，序列如SEQIDNo.10所示；rs12248560T型基因反向引物，序列如SEQIDNo.11所示；Taqman探针，序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.8、SEQIDNo.12、SEQIDNo.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQIDNo.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQIDNo.14所示；所述DNA聚合酶可以是一类经基因工程改造后具有很强抗PCR抑制剂的TaqDNA聚合酶突变体，或者是具有强PCR抑制剂耐受性的其他DNA聚合酶。所述DNA聚合酶包括Taq聚合酶、Phusion聚合酶、Phire聚合酶、Tth聚合酶，以及它们的突变体，也可以是几种酶的混合。优选为Taq聚合酶及其突变体。上述的探针及引物的具体序列如表1所示。表1CYP2C19基因突变检测试剂盒所含引物探针序列序列类型基因标记SEQIDNO.引物序列正向引物2*A1TCCCACTATCATTGATTATTTCCCA正向引物2*G2CCCACTATCATTGATTATTTCGCG反向引物23TACGCAAGCAGTCACATAACT探针2FAM,BHQ14AGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAAC正向引物3*A5GATTGTAAGCACCCCCcGA正向引物3*G6GATTGTAAGCACCCCCAGG反向引物37AGAACTTTGCCATCTTTTCCAG探针3JOE,BHQ18CCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCT正向引物17*T9TTTGTGTCTTCTGTTCTCAATGT正向引物17*C10TTGTGTCTTCTGTTCTCAATGC反向引物1711ACACGTGAAGGCAGGAATTG探针17CY5,BHQ212TGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGC正向引物β-globin13ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT反向引物β-globin14AGGCACCGAGCACTTTCTTG探针β-globinROX,BHQ215TCCACTCCTGATGCTGTTATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；其中，所述Oligo Mix A含有：rs4244285G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.1所示；rs4244285G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；rs4986893G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.5所示；rs4986893G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；rs12248560C型基因正向引物，序列如SEQ ID No.9所示；rs12248560C型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ ID No.14所示；所述Oligo Mix B含有：rs4244285A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.2所示；rs4244285A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；rs4986893A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.6所示；rs4986893A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；rs12248560T型基因正向引物，序列如SEQ ID No.10所示；rs12248560T型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ ID No.14所示；所述DNA聚合酶选自Taq酶、Phusion聚合酶、Phire聚合酶、Tth聚合酶及其它们的突变体中的一种或多种。...

【技术特征摘要】
1.一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR反应液、OligoMixA、OligoMixB、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；其中，所述OligoMixA含有：rs4244285G型基因正向引物，序列如SEQIDNo.1所示；rs4244285G型基因反向引物，序列如SEQIDNo.3所示；rs4986893G型基因正向引物，序列如SEQIDNo.5所示；rs4986893G型基因反向引物，序列如SEQIDNo.7所示；rs12248560C型基因正向引物，序列如SEQIDNo.9所示；rs12248560C型基因反向引物，序列如SEQIDNo.11所示；Taqman探针，序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.8、SEQIDNo.12、SEQIDNo.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQIDNo.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQIDNo.14所示；所述OligoMixB含有：rs4244285A型基因正向引物，序列如SEQIDNo.2所示；rs4244285A型基因反向引物，序列如SEQIDNo.3所示；rs4986893A型基因正向引物，序列如SEQIDNo.6所示；rs4986893A型基因反向引物，序列如SEQIDNo.7所示；rs12248560T型基因正向引物，序列如SEQIDNo.10所示；rs12248560T型基因反向引物，序列如SEQIDNo.11所示；Taqman探针，序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.8、SEQIDNo.12、SEQIDNo.15所示；PCR上游通用引物，序列如SEQIDNo.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQIDNo.14所示；所述DNA聚合酶选自Taq酶、Phusion聚合酶、Phire聚合酶、Tth聚合酶及其它们的突变体中的一种或多种。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，如SEQIDNo.4所示的Taqman探针是FAM通道通用Taqman探针，如SEQIDNo.8所示的Taqman探针是JOE通道通用Taqman探针，如SEQIDNo.12所示的Taqman探针是CY5通道通用Taqman探针，如SEQIDNo.15所示的Taqman探针是内参ROX通道通用Taqman探针。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在FAM通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQIDNo.4所示Taqman探针、如SEQIDNo.3所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的正向引物；在JOE通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQIDNo.8所示Taqman探针、如SEQIDNo.7所示的反向引物和rs4986893Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4986893Arms引物为如SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的正向引物；在CY5通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQIDNo.12所示Taqman探针、如SEQIDNo.11所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的正向引物；在ROX通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQIDNo.15所示Taqman探针、如SEQIDNo.14所示的PCR下游通用引物和如SEQIDNo.13所示PCR上游通用引物，三者的浓度分别为0.05～0.1μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为分别包含6个SNP位点和1个内参片段的7个pUC57质粒的混合物；其中，所述6个SNP位点分别为如SEQIDNo.16所示的SNP位点上rs4244285的G型、如SEQIDNo.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜恒骏，仁青措，沈维祥，张小燕，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31