一种检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括：1)DNA提取试剂，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的标准品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液II。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，特异性好，检测方法简单快捷，实验结果可靠，不仅可以筛查SCID和抗体缺乏为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞和B细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术属于体外核酸诊断领域，涉及一种检测T细胞受体切除环(T-cellreceptorexcisioncircles，TRECs)和K-删除重组切除环(K-deletingrecombinationexcisioncircles，KRECs)基因的实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒及其应用。
技术介绍
重症联合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID)是联合免疫缺陷病中最严重的类型，患者常常在出生后1年内死亡。根据国外大范围筛查得出SCID的发生率约为1/58000活产新生儿，显著高于以往认为的1/100000。SCID是由多种遗传因素引起的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞数量缺乏和(或)功能障碍，导致体液免疫、细胞免疫同时存在严重缺陷，这种原发性免疫缺陷常被定义为初始T细胞缺乏。不经治疗，SCID的病死率为100％。目前常用的治疗方法为造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)、基因治疗(genetherapy,GT)或酶替代治疗(enzymereplacementtherapy,ERT)进行免疫重建。Pai等通过随访240例移植后的SCID患者，认为<3.5月龄的SCID患者移植的存活率显著高于>3.5月龄或继发感染的患儿，且移植后的存活率主要与患儿有无感染相关，与移植物的来源无明显关联。因此，对SCID患者进行早期诊断及早期治疗，可显著改善患儿的预后。SCID患儿多数存在T细胞缺乏，因此淋巴细胞绝对计数可作为SCID的筛查手段之一。Chan和Puck在2005年首先报道了采用定量PCR方法检测T细胞受体切除环(T－cellreceptorexcisioncircles,TRECs)。TRECs是TCR形成过程中产生的无功能的DNA片段，约70％的αβTCR在生成过程中可同时生成TRECs，这些DNA片段不随T细胞的分裂而复制，稳定存在于细胞内，因此TRECs定量可以间接反映胸腺输出的初始T淋巴细胞数量。若TRECs减少或缺失，则高度怀疑SCID，进一步进行流式细胞及基因诊断确诊。通过TRECs筛查SCID可以与其他新生儿常规筛查项目共用干血纸片，有利于该筛查方法的正式大范围推广。除了SCID外，TRECs检测还能发现包括21三体、DiGeorge综合征、特发性T淋巴细胞减少症等其他引起T淋巴细胞计数严重减少的疾病。TRECs检测价格便宜，包括设备、劳务和试剂等所需要的费用约为4.25美元/婴儿，与其他筛查项目价格相当或更低；方法高度敏感、特异，筛选试验的灵敏度接近100％，可有效检出SCID患儿；因此采用TRECs进行SCID新生儿筛查可有效应用到公共卫生事业，被认为是美国"国家标准的新生儿筛查项目"。一些非特异、表现延迟的SCID患者出生时仅通过TRECs检测可能遗漏，需要K－删除重组切除环等其他检测手段协诊。KRECs是B细胞成熟过程中，编码B细胞受体基因重排时产生的非复制的小片段DNA产物，可以作为伴有B细胞数量减少的B淋巴细胞免疫缺陷的筛查方法。例如延迟性ADA患者中，T细胞分裂可能对有毒代谢产物增加的耐受性较好，而B细胞则更容易裂解，KRECs有利于此类患者的早期发现；KRECs在X－连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的筛查中也发挥着重要作用。理想情况下，应该联合TRECs－KRECs进行新生儿免疫缺陷的筛查。据估计，SCID和无丙种球蛋白血症共同的发病率为1/50000～1/30000，同时检测TRECs及KRECs不仅可扩大疾病筛查谱，而且整体上可以提高新生儿疾病筛查的成本效益。法国一项研究对2006年至2010年的SCID筛查成本分析显示，SCID的早期检出可以使每例患者的治疗成本降低50000～100000欧元；假设测试的单位成本为5欧元，SCID收支平衡所需的疾病发生率约为1/20000；然而一旦3月龄内进行干细胞移植的生存优势被证实，人群大范围疾病筛查可以明显节省成本。最重要的是，SCID病例出生后的检出允许患儿及时得到治疗，避免了并发症出现后长期、昂贵的重症监护和显著增加的医疗成本。早期筛查可提高治愈率，大大改善了生活质量，降低了社会负担，尽早识别SCID显得至关重要。申请号为201210470713.5的中国专利申请提供了定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用。该专利采用包括巢式PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增的两步法，操作复杂繁琐、耗时长，没有明确的参考阈值，尤其是采用的DNA提取方法提取的DNA纯度不高、巢式PCR带来的扩增误差、巢式PCR之后的移液操作带来的样本污染，诸多环节累计的误差最终导致漏检的可能性大。在筛查过程中如发生漏检，患儿将错过最佳诊断和治疗时机。针对上述问题，本专利技术首先对DNA提取方法进行了改进，减少操作步骤、减短耗时，获得更高纯度的DNA，然后还优化了引物及探针，采用一步实时荧光定量PCR扩增法来减少扩增误差和样品污染，使TRECs和KRECs基因检测试剂盒具有更高灵敏度和特异性，同时操作简便快速。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种灵敏度和特异性更高且快速简便的，用来筛查新生儿原发性T细胞和B细胞免疫缺陷的用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上所有类型的荧光定量PCR扩增仪。本专利技术能够检测新生儿T细胞和B细胞的水平，判断新生儿免疫系统功能是否正常，在临床检验领域有良好的应用前景。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述实时荧光定量PCR试剂盒在筛查新生儿T细胞和B细胞免疫缺陷中的应用，上述试剂盒所需的样本获取、运输、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果准确可靠。为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括：1)DNA提取试剂，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的标准品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液II。在本专利技术的一个具体方案中，所述TRECs基因的荧光PCR引物包含TRECs荧光PCR正向引物和反向引物；所述TRAC基因的荧光PCR引物包含TRAC荧光PCR正向引物和反向引物；所述KRECs基因的荧光PCR引物包含KRECs荧光PCR正向引物和反向引物；所述检测探针为TRECs检测探针、TRAC检测探针或KRECs检测探针。在本专利技术的一个具体方案中，所述荧光PCR反应液I是由TRECs荧光PCR正向引物、反向引物和TRECs检测探针，TRAC荧光PCR正向引物、反向引物和TRAC检测探针，2XrealtimeMix和无菌的超纯水组成；所述TRECs荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000nM，优选为400nM；所述TRAC荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括：1)DNA提取试剂，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的标准品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液II。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括：1)DNA提取试剂，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的标准品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液II。2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述TRECs基因的荧光PCR引物包含TRECs荧光PCR正向引物和反向引物；所述TRAC基因的荧光PCR引物包含TRAC荧光PCR正向引物和反向引物；所述KRECs基因的荧光PCR引物包含KRECs荧光PCR正向引物和反向引物；所述检测探针为TRECs检测探针、TRAC检测探针或KRECs检测探针。3.如权利要求2所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液I是由TRECs荧光PCR正向引物、反向引物和TRECs检测探针，TRAC荧光PCR正向引物、反向引物和TRAC检测探针，2XrealtimeMix和无菌的超纯水组成；所述TRECs荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000nM，优选为400nM；所述TRAC荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000nM，优选为400nM；所述TRECs检测探针和TRAC检测探针的含量分别为50-250nM，优选为100nM。4.如权利要求3所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述TRECs荧光PCR正向引物的序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的序列如SEQIDNO.2所示，TRECs检测探针的序列如SEQIDNO.3所示；TRAC荧光PCR正向引物的序列如SEQIDNO.7所示，反向引物的序列如SEQIDNO.8所示，TRAC检测探针的序列如SEQIDNO.9所示。5.如权利要求2所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液II是由KRECs荧光PCR正向引物、反向引物和KRECs检测探针，TRAC荧光PCR正向引物、反向引物和TRAC检测探针，2XrealtimeMix和无菌的超纯水组成；所述KRECs荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000nM，优选为400nM；所述TRAC荧光PCR正向引物和反向引物的含量分别为300-1000nM，优选为400nM；所述KRECs检测探针、TRAC检测探针含量分别为50-250nM，优选为100nM。6.如权利要求5所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述KRECs荧光PCR正向引物的序列如SEQIDNO.4所示，反向引物的序列如SEQIDNO.5所示，KRECs检测探针的序列如SEQIDNO.6所示；TRAC荧光PCR正向引物的序列如SEQIDNO.7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱智，李艳艳，欧恩智，陈珺，
申请(专利权)人：朱智，陈珺，
类型：发明
国别省市：上海,31