用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用，涉及基因工程技术领域，本发明专利技术提供的用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物。具有开发成本低，研发周期短，准确性高等特点，能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。并且，该引物组具有特异性强，准确度高，DNA测定范围广的优点，有利于推动针对该位点的硝酸甘油个体化用药基因的临床检测。本发明专利技术提供的乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，检测成本低，采用本发明专利技术提供的检测方法能够经济、准确，快速地分析ALDH2 rs671位点的基因型，这对于硝酸甘油个体化用药基因检测的临床推广具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用。
技术介绍
硝酸甘油(GTN,glyceryltrinitrate,nitroglycerin)用于治疗心绞痛和心力衰竭己有130年的历史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选药方，但其临床有效性常因人而异。有的人因它而及时挽救了生命，而有的人服用之后，效果却不甚明显。以往国内外医学界一直认为硝酸甘油对部分病人疗效不佳是因其“耐药性”所致，但研究结果证实并非如此。近来的研究表明基因突变是影响硝酸甘油药物疗效的决定性因素。乙醛脱氢酶2基因(ALDH2)是线粒体ALDH的主要编码基因，定位于12号染色体。ALDH2具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)，我们饮酒后产生的乙醛主要是由ALDH2参与氧化代谢的。除了上述的脱氢酶活性以外，ALDH2还有醋酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生1,2-二硝基甘油和亚硝酸盐。迄今为止，研究者在人类ALDH2基因的序列上发现了84个单核普酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点，但研究主要集中在rs671位点上，即ALDH2基因第12外显子中的一个SNP，导致赖氨酸替代了原有的谷氨酸(G1u504Lys)。G1u504Lys是ALDH2基因上最重要的一个SNP位点，该位点与ALDH2蛋白的空间结构有关，因此影响该酶的活性。在人群中，ALDH2酶的基因以3种形式出现，具有正常催化乙醛活性的野生纯合型G/G，即ALDH2*1*1；催化活性下降的突变杂合子型G/A(只有ALDH2蛋白正常水平的6.25％)，即ALDH2*1*2；失去催化活性的突变纯合子型A/A，即ALDH2*2*2。研究成果表明，人体内线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)是硝酸甘油的有效代谢一氧化氮形成的关键。如果病人体内的线粒体乙醛脱氢酶2的基因Lys-504发生突变，就会影响线粒体乙醛脱氢酶2的醋酶活性，使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，致一氧化氮减少甚至无法产生一氧化氮，也就难以有效发挥作用。因此，对需要含服硝酸甘油药物的病人进行ALDH2基因的SNP检测尤为重要。目前硝酸甘油代谢敏感型基因ALDH2分型检测常用方法为Taqman探针-qPCR法，该方法是利用位点特异性Taqman探针来完成基因分型检测。然而，Taqman探针-qPCR方法具有开发成本高、周期长等缺点，使得基于该方法的临床基因检测成本较高，限制了基因检测技术的临床推广。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，以缓解现有技术中存在的Taqman探针-qPCR检测乙醛脱氢酶2基因分型具有开发成本高、周期长的技术问题。本专利技术的第二个目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂。本专利技术的第三个目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒。本专利技术的第四个目的在于提供一种乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，该方法工艺简单，操作方便，检测成本低，同时能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。本专利技术的第五个目的在于提供上述引物组或试剂或试剂盒在检测个体对硝酸甘油药物敏感性中的应用。本专利技术提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，所述引物组包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物；所述共用上游引物为ALDH2-F，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述等位基因特异引物包括ALDH2-g-R和ALDH2-a-R，所述ALDH2-g-R具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述ALDH2-a-R具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；所述中间序列特异引物为ALDH2-mid，具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。进一步的，所述等位基因特异引物ALDH2-g-R和ALDH2-a-R，分别含有通用引物序列和与通用探针反向互补的序列；优选地，所述ALDH2-g-R含有与FAM通用探针反向互补的序列，FAM信号代表G基因型，所述ALDH2-g-R含有与HEX通用探针反向互补的序列，HEX信号代表A基因型。本专利技术还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂，所述试剂包括上述的引物组。本专利技术还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。进一步的，所述试剂盒还包括2*PCRMix、2*UP-qPCRMix、PrimerMix、qPrimerMix、ddH2O和阳性标准品。进一步的，所述PrimerMix包括浓度分别为2μM的ALDH2-F、ALDH2-g-R和ALDH2-a-R，溶剂为灭菌双蒸水；所述qPrimerMix包括浓度为8μM的ALDH2-mid，溶剂为灭菌双蒸水。本专利技术还提供了一种乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，应用上述的引物组或试剂或试剂盒。进一步的，以待测样本的DNA为模板，利用所述引物组进行实时荧光定量PCR反应，根据检测到的荧光信号判定乙醛脱氢酶2的基因型。进一步的，还包括将所述待测样本中含有特异位点的DNA进行富集的步骤；优选地，通过PCR的方法对所述待测样本中含有特异位点的DNA进行富集；优选地，利用ALDH2-F、ALDH2-g-R和ALDH2-a-R作为引物进行所述PCR反应。另外，本专利技术还提供了上述的引物组或试剂或试剂盒在检测个体对硝酸甘油药物敏感性中的应用。本专利技术提供的用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物。本专利技术利用通用探针技术开发的针对ALDH2rs671位点的基因分型引物组，具有开发成本低，研发周期短，准确性高等特点，能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。并且，该引物组具有特异性强，准确度高，DNA测定范围广(1ng-100ng/10μL体系)的优点有利于推动针对该位点的硝酸甘油个体化用药基因的临床检测。本专利技术提供的乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，应用了本专利技术提供的引物组或试剂或试剂盒。该方法工艺简单，操作方便，检测成本低，大样本检出率达到98.8％，检测周期小于3h。因此，采用本专利技术提供的检测方法能够经济、准确，快速地分析ALDH2rs671位点的基因型，这对于硝酸甘油个体化用药基因检测的临床推广具有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的阳性参照样本基因分型散点图；图2A为本专利技术实施例2提供的GG型阳性参照样本基因分型曲线；图2B为本专利技术实施例2提供的GA型阳性参照样本基因分型曲线；图2C为本专利技术实施例2提供的AA型阳性参照样本基因分型曲线；图2D为本专利技术实施例2提供的NTC样本基因分型曲线；图3A为本专利技术实施例3提供的样本号为1-28的基因分型散点图；图3B为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物；所述共用上游引物为ALDH2‑F，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述等位基因特异引物包括ALDH2‑g‑R和ALDH2‑a‑R，所述ALDH2‑g‑R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述ALDH2‑a‑R具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述中间序列特异引物为ALDH2‑mid，具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物；所述共用上游引物为ALDH2-F，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述等位基因特异引物包括ALDH2-g-R和ALDH2-a-R，所述ALDH2-g-R具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述ALDH2-a-R具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；所述中间序列特异引物为ALDH2-mid，具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述等位基因特异引物ALDH2-g-R和ALDH2-a-R，分别含有通用引物序列和与通用探针反向互补的序列；优选地，所述ALDH2-g-R含有与FAM通用探针反向互补的序列，FAM信号代表G基因型，所述ALDH2-g-R含有与HEX通用探针反向互补的序列，HEX信号代表A基因型。3.一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1或2所述的引物组。4.一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培峰，李保伟，刘英，郝晓丹，吴薇，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37