一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物制造技术

本发明专利技术涉及一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，所述组合物包括hsa‑miR‑1285‑5p、hsa‑miR‑193a‑5p和hsa miR‑26a‑5p，核苷酸序列分别见SEQ ID NO.1‑3。本发明专利技术解决了现有技术中采用肝组织学检查来评估慢性乙肝炎症损伤带来有创性和局限性的问题，通过qRT‑PCR对上述miRNA组合物进行检测，可以实现对慢性乙肝炎症损伤的早期诊断，miRNA作为生物学标志物是一种非侵入性取样，可以在无创条件下通过单独的miRNA或miRNA组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否有慢性乙肝炎症损伤，提高了病情判断的准确率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物
本专利技术涉及一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，属于医学检验

技术介绍
微小RNA(microRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度为18～24个核苷酸。近年对微小RNA生物功能的研究越来越多，发现其在机体生理及病理方面起重要作用，生理情况下参与细胞的增殖、分化过程，若表达及功能失调则可能导致包括白血病在内的肿瘤的发生，以及病毒、细菌感染等多种病理现象。微小RNA普遍存在于人类的体液中，性质稳定，可以定量检测，且存在显著的疾病特异性。近年的研究表明，血液、唾液、尿液、乳汁及脑脊液等体液miRNA检测可应用于妊娠等生理状态的判断以及口腔癌、膀胱癌及阿尔海默茨病等疾病的诊断和预后判断。体液特异性miRNA检测的临床意义及应用前景已引起高度关注，miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物。体液miRNA含量丰富且性质稳定，具备成为优异生物标志物的潜质，并且拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物不具备的特性，无需抗体制备且易于精确定量，可能克服抗原抗体类生物标志物的制备瓶颈。肝脏是人体内重要的器官之一，肝脏疾病尤其是病毒性肝炎、肝细胞癌、酒精性肝炎等病情重，治疗棘手，严重困扰着人类的健康，研究肝脏疾病的发病机制对其治疗至关重要。不断有研究发现，微小RNA与多种肝脏疾病相关，肝脏中的微小RNA表达异常或缺失可导致肝细胞凋亡、再生，甚至感染等，微小RNA参与众多肝脏疾病的病理发病过程。在众多肝脏疾病中，肝细胞癌和微小RNA的相互关系研究最多。近年研究发现，微小RNA失调和癌症发生发展密切相关，微小RNA参与癌症的病理发病过程。肝细胞癌的发生同样受微小RNA的调控，已发现在肝细胞癌中表达上调的微小RNA有miR-2l、miR-34a、miR-22l/222和miR-224等，而表达下调的有miR-122、miR-145和miR-199a等。ALT是肝功能损害最敏感的检测指标,也是各种指南关于慢性乙肝抗病毒治疗和预后判断的重要指标,但很多ALT正常的慢性HBV感染者肝组织学均提示有严重的炎症反应损伤,一部分患者甚至出现肝硬化表现。因此2010年我国慢性乙肝防治指南明确建议对>40岁或有HCC家族史的男性，即使ALT正常建议肝组织学检查，以明确肝组织的损伤，以免耽误抗病毒治疗。肝组织学检查虽然是确切了解肝组织损伤的金标准，但其有创性和局限性，不能被大多患者接受。因此，寻找到新的诊断方法和更敏感的生物学标志是慢性乙肝迫切要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述不足，提供一种用于预测慢性乙肝的miRNA组合物。技术方案一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，所述组合物包括hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-193a-5p和hsamiR-26a-5p。进一步，所述hsa-miR-1285-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1：GAUCUCACUUUGUUGCCCAGG。进一步，所述hsa-miR-193a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2：UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA。进一步，所述hsamiR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU。用于检测上述miRNA组合物的引物组，包括针对hsa-miR-1285-5p的特异性引物，针对hsa-miR-193a-5p的特异性引物以及针对hsamiR-26a-5p的特异性引物；所述针对hsa-miR-1285-5p的特异性引物包括SEQIDNO.4所示的正向引物和SEQIDNO.5所示的反向引物，所述针对hsa-miR-193a-5p的特异性引物包括SEQIDNO.6所示的正向引物和SEQIDNO.7所示的反向引物，所述针对hsamiR-26a-5p的特异性引物包括SEQIDNO.8所示的正向引物和SEQIDNO.9所示的反向引物。上述用于检测miRNA组合物的引物组在预测或诊断慢性乙肝炎症损伤方面的应用。采用该引物组，通过qRT-PCR对上述miRNA组合物进行检测，可以实现对慢性乙肝炎症损伤的早期诊断，为慢性乙肝炎症损伤的早期发现和诊断提供参考。一种慢性乙肝炎症损伤的诊断试剂盒，包括上述用于检测miRNA组合物的引物组。进一步，所述miRNA组合物的筛选方法包括如下步骤：(1)样品采集：采集患者新鲜血液，2h内分离，收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中，-80℃保存，备用；(2)总RNA提取：采用LCSTRK1001试剂盒(LCSciences)操作说明书进行；(3)文库构建：使用IlluminaTruseqSmallRNAPreparationkit试剂盒参照试剂盒说明书Illumina’sTruSeqSmallRNASamplePreparationGuide构建小RNA文库，总RNA链接5'接头和3'接头后经RT-PCR扩增形成小分子RNA的cDNA文库，经过6％TBE变性胶电泳分离，将长度范围在147bp的小分子RNA切胶回收；(4)第二代测序：cDNA经纯化后在Illumina’sClusterStation上生成DNA簇后上机(IlluminaGAIIx)进行测序，通过Illumina’sSequencingControlStudiosoftwareversion2.8(SCSv2.8)软件实时分析测序图片并使用Illumina'sReal-TimeAnalysisversion1.8.70(RTAv1.8.70)提取base-calling，提取的原始序列利用ACGT101-miRv4.2(LCSciences)软件分析，生成RawData数据库，同时去除由于样品制备、测序化学与处理以及测序仪器的光学数码处理而产生的非纯序列，剩下的序列(长度在15和32bases)按照families进行分组，生成mappableReads。Mappable序列与最新版本的miRbase数据库以及测序物种基因组进行序列比对，鉴定该物种已知的miRNA；同时发现新的5p或者3pmiRNA序列，鉴定在其它近源物种中已有报道，在该物种中崭新的miRNA序列。其中Mappable序列能与Rfam(ierRNA,tRNA,snRNA,snoRNAandothers)，Repbase以及mRNA序列比对上的均被去除。除此之外，为了保证筛选到高质量的基因结果，把reads数小于10的基因剔除掉。最后分析实验组和对照组之间差异表达的miRNAs，最终获得hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-193a-5p和hsamiR-26a-5p。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，通过qRT-PCR对该miRNA组合物进行定量检测，实现对慢性乙肝肝纤维化的早期诊断和预测，miRNA作为生物学标志物是一种非侵入性取样，可以在无创条件下通过单独的miRNA或miRNA组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否有慢性乙肝炎症损伤，提高了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，其特征在于，所述组合物包括hsa‑miR‑1285‑5p、hsa‑miR‑193a‑5p和hsamiR‑26a‑5p。

【技术特征摘要】
1.一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，其特征在于，所述组合物包括hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-193a-5p和hsamiR-26a-5p。2.如权利要求1所述的用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，其特征在于，所述hsa-miR-1285-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，其特征在于，所述hsa-miR-193a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求1或2或3所述的用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物，其特征在于，所述hsamiR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。5.用于检测权利要求1至4任一项所述miRNA组...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭友文，陈丽，叶云，
申请(专利权)人：镇江市第三人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32