一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由分别用于扩增MTHFR基因rs1801133、MTHFR基因rs1801131的2个位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明专利技术所述试剂盒用于检测人类MTHFR基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

【技术实现步骤摘要】
一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
人类亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，亚甲基四氢叶酸还原酶)基因位于第一号染色体1p36.3，共有12个外显子，编码656个氨基酸残基组成的蛋白，MTHFR是参与叶酸循环代谢的一个重要酶，与DNA的合成甲基化等相关，主要作用是将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。叶酸是一种B族维生素，是细胞分裂合成DNA时不可缺少的成分，叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。编码MTHFR的基因位点突变对酶的活性和热稳定性产生影响。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性下降，杂合MTHFR677CT酶活性下降30％，纯合677TT酶活性下降65％以上。MTHFRA1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFRC677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接途径障碍，导致血液中叶酸浓度降低，人体缺乏叶酸可引起巨幼红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。目前临床上主要采取以下四种方式检测MTHFR基因的多态性：1.PCR-测序法2.高分辨率溶解曲线法3.芯片杂交法4.Taqman-qPCR法PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中MTHFR基因多态性进行检测。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种人类MTHFR基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：MTHFR677-F1：5'-CTCTCCTGACTGTCATCCCTAT-3'SEQIDNO.1MTHFR677-F2：5'-FAM-AAGATACATTGATGAGGGAGTCG-3'SEQIDNO.2(特异识别突变模板)MTHFR677-R1：5'-GCGGAAGAATGTGTCAGCCT-3'SEQIDNO.3MTHFR677-R2：5'-VIC-ATCCCTTGTCATCGTATCGCGTC-3’SEQIDNO.4(特异识别野生模板)MTHFR1298-F1：5'-AGAGCAAGTCCCCCAAGGAG-3'SEQIDNO.5MTHFR1298-F2：5'-FAM-AAGATACATTGATGATGAAGCAAG-3'SEQIDNO.6(特异识别突变模板)MTHFR1298-R1：5'-CCGAGAGGTAAAGAACGAAGACT-3'SEQIDNO.7MTHFR1298-R2：5'-VIC-ATCCCTTGTCATCGTCACTTTCT-3’SEQIDNO.8(特异识别野生模板)内控F：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’SEQIDNO.9内控R：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’SEQIDNO.10。一种人类MTHFR基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’SEQIDNO.11野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’SEQIDNO.12突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’SEQIDNO.13。一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒由分别用于扩增MTHFR基因rs1801133、MTHFR基因rs1801131位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液的具体组分如下：(1)用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的PCR预混反应液：所述用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的引物、引物序列如SEQIDNO：1～4所示，用于内控的引物序列、序列如SEQIDNO：9～10所示，所述探针组、序列如SEQIDNO：11～13所示，以及PCR反应液组成；(2)用于扩增MTHFR基因rs1801131位点的PCR预混反应液：所述用于扩增MTHFR基因rs1801131位点的引物，引物序列如SEQIDNO：5～8所示；用于内控的引物序列，序列如SEQIDNO：9～10所示；所述探针组，序列如SEQIDNO：11～13所示；以及PCR反应液组成；所述阳性对照品包括：MTHFR基因rs1801133位点野生型质粒、MTHFR基因rs1801133位点突变型质粒、MTHFR基因rs1801131位点野生型质粒、MTHFR基因rs1801131位点突变型质粒及内参基因质粒DNA；所述阴性对照品包括不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。上述方案中，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的各引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。上述方案中，所述PCR反应液包括PremixqPCRmix和TE缓冲液。上述方案中，所述阴性对照品由PUC-19质粒空载体和TE缓冲液组成。上述检测试剂盒在制备用于检测人类MTHFR基因多态性产品中的应用，具体地应用方式如下：采用人类MTHFR基因多态性检测试剂盒检测人类MTHFR基因多态性的过程，具体包括如下步骤：(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；(2)荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。上述方案中，步骤(2)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组，其特征在于，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增MTHFR基因rs1801131位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.8所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于内控的引物序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.10所示。

【技术特征摘要】
1.引物组，其特征在于，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的特异性引物序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.4所示，其中SEQIDNO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增MTHFR基因rs1801131位点的特异性引物序列如SEQIDNO.5~SEQIDNO.8所示，其中SEQIDNO.6所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQIDNO.8所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于内控的引物序列如SEQIDNO.9~SEQIDNO.10所示。2.探针组，其特征在于，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，核苷酸序列如SEQIDNO.11~SEQIDNO.13所示，具体形式如下：内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’。3.一种检测试剂盒，包含权利要求1所述引物组和权利要求2所述探针组，其特征在于，所述试剂盒由分别用于扩增MTHFR基因rs1801133、MTHFR基因rs1801131位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液的具体组分如下：用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的PCR预混反应液：所述用于扩增MTHFR基因rs1801133位点的引物、引物序列如SEQIDNO：1~4所示，用于内控的引物序列、序列如SEQIDNO：9~10所示，所述探针组、序列如SEQIDNO：11~13所示，以及PCR反应液组成；用于扩增MTHFR基因rs1801131位点的PCR预混反应液：所述用于扩增MTHFRrs1801131位点的引物，引物序列如SEQIDNO：5~8所示；用于内控的引物序列，序列如SEQIDNO：9~10所示；所述探针组，序列如SEQIDNO：11~13所示；以及PCR反应液组成；所述阳性对照品包括：MTHFR基因rs1801133位点野生型质粒、MTHFR基因rs1801133位点突变型质粒、MTHFR基因rs1801131位点野生型质粒、MTHFR基因rs1801131位点突变型质粒及内参基因质粒DNA；所述阴性对照品包括不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：付金玲，王宁，李倩，李雪梅，叶伦，程弘夏，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42