基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法制造技术

本发明专利技术属于恶性疟原虫检测技术领域，具体涉及基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，包括以下步骤：步骤一，生物信息学分析，搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体阶段高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，作为平行对照；步骤二，LAMP引物设计；利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成。步骤三，模版DNA制备；步骤四，引物配制；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价。

Loop mediated isothermal amplification based on specific genes of Plasmodium falciparum ring body

The invention belongs to the technical field of detection of Plasmodium falciparum, particularly Plasmodium falciparum ring loop mediated isothermal amplification by unique gene based method comprises the following steps: 1, bioinformatics analysis, PlasmoDB database search, high expression screening only in Plasmodium falciparum erythrocytic stage ring stage (before 20%) and the species of Plasmodium specific genes, verify the different eukaryotic species distribution, using OrthoMCL database at the same time, only in the screening of Plasmodium falciparum trophozoite and schizont stage high expression (20%) and the specific genes of each one, as a parallel control; step two, LAMP primer design; LAMP the primers were designed using LAMP design software online PrimerExplorerV4 specific gene on the steps of a screening to the parameter set to the default, select the top two to the top five scores The LAMP primers were then subjected to LAMP primer synthesis. Step three, template DNA preparation; step four, primer preparation; step five; establishment of LAMP method and evaluation of sensitivity and specificity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于恶性疟原虫检测
，具体涉及基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法。
技术介绍
疟疾是严重危害人类健康的全球三大公共卫生问题之一，在可引起人体疟疾的5种疟原虫中，由恶性疟原虫引起的恶性疟最为严重，常以畏寒、发热、头痛为首发症状，并发症多，若不及时治疗容易危及生命。该病在撒哈拉以南非洲地区流行普遍，发病率和死亡率极高，特别是孕妇和五岁以下儿童深受其害。20世纪70年代以后，随着疟疾疫情下降，低原虫血症患者所占比例增大，混合感染病例增多。此外，病人药物治疗后的复查或正处于慢性感染阶段等对镜检的要求提高。常规血膜涂片染色镜检法很可能会导致误诊或漏诊，因此，作为金标准的镜检已难以适应疫情变化后的检测需求。此外，由于镜检需要长时间观察、专业判别和复核，难以广泛应用。同时，免疫学方法的不稳定，PCR耗时长、花费高，使得一直以来都难以找到一种实用性和适用性兼备的恶性疟原虫检测方法。2016年世界疟疾报告显示，2015年全球约有2.12亿疟疾新增病例，其中死亡病例约429000例。目前，我国疟疾疫情已经由本地病例为主转变为输入性病例为主，且输入性病例比例逐年上升。特别是近年来，随着国内外经贸往来频繁，出国经商、旅游、留学和度假日益增多，造成我国输入性疟疾疫情愈来愈突出。因此，寻找一种操作简单、快速高效、高特异性和高灵敏度的检测方法迫在眉睫。传统的疟疾检测方法是厚薄血膜涂片经染色后镜检。其优点是操作简单、成本低，能够进行虫种鉴别；不足之处在于其费时、费力，对检验者的专业要求高，特别是检测低原虫血症样本时易漏诊。因此，研究人员建立了基于酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)的疟疾免疫学快速诊断方法。这些方法能够实现检出疟原虫感染的目的，敏感性可与专业镜检媲美，然而其检测效能并不稳定。随后，研究人员开发了基于DNA扩增的分子生物学技术，最常用的有PCR、巢式PCR和实时定量PCR。与镜检相比，分子生物学方法具有更高的灵敏度(最低可检测1～5个疟原虫/μl)和更好的特异性；但该技术存在费用高、须由专业高科技人员操作，且只能在设施配置齐全的实验室进行，从而限制了其在基层医院和医疗卫生条件相对较差地区的应用，而这些地区通常又是疟疾流行范围最广、危害最严重的地区。因此，迫切需要研发一种新的疟疾诊断技术，以弥补镜检、免疫学和常规分子生物学方法的不足。环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年开发出来的一种新的恒温核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)下温育30～60min即可完成DNA扩增反应。与普通PCR相比，LAMP技术不需要模板热变性、复杂的温度循环、长时间电泳及凝胶成像等过程，具有简单、快速、高度灵敏、特异性强的特点，这些独特的优势使其更能为广大医务工作者所接受。目前，已建立了基于恶性疟原虫编码CSP蛋白基因和18SrRNA的LAMP技术，并广泛应用于现场调查。然而，此类高度保守基因在疟原虫属乃至疟原虫科都广泛存在，加之LAMP法是一种高敏感性和特异性的技术，极易造成假阳性，从而导致虫种误判。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，用以解决现有恶性疟原虫检测方法存在误判等诸多的问题。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，包括以下步骤：步骤一，生物信息学分析：搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCLdatabase验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，做为平行对照；步骤二，LAMP引物设计：利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成；步骤三，模版DNA制备：使用血液基因组DNA提取试剂盒分别提取含有恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫的全血基因组DNA；使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取感染弓形虫的小鼠腹水DNA；上述试剂盒所提取的基因组DNA即为LAMP使用的模板DNA；步骤四，引物配制：LAMP引物存储液配制：将步骤二得到的置于1.5ml离心管的LAMP引物干粉在12000r/min下离心1min，以使粘在管盖和管壁的粉末全部集中在管底。配制母液：根据引物干粉摩尔数溶解干粉于1.5ml离心管，配制内引物(FIP/BIP)母液的浓度为200pmol/μl，外引物(F3/B3)母液的浓度为100pmol/μl，将配制好的内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室温放置5min，振荡混合均匀后放入离心机，在12000r/min下离心1min；LAMP引物工作液PM制备：取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl，最后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价：A.LAMP反应体系包括12.5μl2×RM反应液，1μl步骤四得到的LAMP引物工作液PM，1μl和相对应基因的DNA模板，1μlBstDNAPolymerase，加超纯水至25μl，混合均匀后加入12.5μl密封液再次离心，最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，轻轻盖紧管盖，恒温金属浴内反应，终止反应后颠倒PCR管数次或1000～16000r/min离心30sec～3min，使显色液与反应混合液充分混匀，短暂离心后观察反应液颜色变化，若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，若呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增)；B.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA用超纯水进行倍比稀释，然后按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，评价所检测基因的敏感性；C.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有间日疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有约氏疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有弓形虫基因组DNA的腹水DNA；按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，以18SrRNA设计的LAMP引物作为阳性对照引物，进行特异性评价，同时设立空白对照和阴性对照。作为优选的，所述步骤一中恶性疟原虫特有基因为PF3D7_1253300，PF3D7_0202200,PF3D7_0702300,PF3D7_1001900,PF3D7_1002000,PF3D7_1148900,PF3D7_1240100,PF3D7_1301700与PF3D7_1334700，这样的设计，可以更好的对恶性疟原虫更好的区别，更好的进行检测。作为优选的，所述步骤一中恶性疟原虫红内期滋养体阶段高表达(前20％)特有基因为PF3D7_0220300，这样的设计，对比性较强。作为优选的，所述步骤一中恶性疟原虫红内期裂殖体阶段高表达(前20％)特有基因为本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，生物信息学分析：搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，做为平行对照；步骤二，LAMP引物设计：利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成；步骤三，模版DNA制备：使用血液基因组DNA提取试剂盒分别提取含有恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫的全血基因组DNA；使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取感染弓形虫的小鼠腹水DNA；上述试剂盒所提取的基因组DNA即为LAMP使用的模板DNA；步骤四，引物配制：LAMP引物存储液配制：将步骤二得到的置于1.5ml离心管的LAMP引物干粉在12000r/min下离心1min，以使粘在管盖和管壁的粉末全部集中在管底。配制母液：根据引物干粉摩尔数溶解干粉于1.5ml离心管，配制内引物(FIP/BIP)母液的浓度为200pmol/μl，外引物(F3/B3)母液的浓度为100pmol/μl，将配制好的内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室温放置5min，振荡混合均匀后放入离心机，在12000r/min下离心1min；LAMP引物工作液PM制备：取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl，最后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价：A.LAMP反应体系包括12.5μl 2×RM反应液，1μl步骤四得到的LAMP引物工作液PM，1μl和相对应基因的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超纯水至25μl，混合均匀后加入12.5μl密封液再次离心，最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，轻轻盖紧管盖，恒温金属浴内反应，终止反应后颠倒PCR管数次或1000～16000r/min离心30sec～3min，使显色液与反应混合液充分混匀，短暂离心后观察反应液颜色变化，若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，若呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增)；B.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA用超纯水进行倍比稀释，然后按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，评价所检测基因的敏感性；C.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有间日疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有约氏疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有弓形虫基因组DNA的腹水DNA；按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，以18S rRNA设计的LAMP引物作为阳性对照引物，进行特异性评价，同时设立空白对照和阴性对照。...

【技术特征摘要】
1.基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，生物信息学分析：搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCLdatabase验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，做为平行对照；步骤二，LAMP引物设计：利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成；步骤三，模版DNA制备：使用血液基因组DNA提取试剂盒分别提取含有恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫的全血基因组DNA；使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取感染弓形虫的小鼠腹水DNA；上述试剂盒所提取的基因组DNA即为LAMP使用的模板DNA；步骤四，引物配制：LAMP引物存储液配制：将步骤二得到的置于1.5ml离心管的LAMP引物干粉在12000r/min下离心1min，以使粘在管盖和管壁的粉末全部集中在管底。配制母液：根据引物干粉摩尔数溶解干粉于1.5ml离心管，配制内引物(FIP/BIP)母液的浓度为200pmol/μl，外引物(F3/B3)母液的浓度为100pmol/μl，将配制好的内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室温放置5min，振荡混合均匀后放入离心机，在12000r/min下离心1min；LAMP引物工作液PM制备：取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl，最后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用；步骤五，LAMP法的建立和敏感性、特异性评价：A.LAMP反应体系包括12.5μl2×RM反应液，1μl步骤四得到的LAMP引物工作液PM，1μl和相对应基因的DNA模板，1μlBstDNAPolymerase，加超纯水至25μl，混合均匀后加入12.5μl密封液再次离心，最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，轻轻盖紧管盖，恒温金属浴内反应，终止反应后颠倒PCR管数次或1000～16000r/min离心30sec～3min，使显色液与反应混合液充分混匀，短暂离心后观察反应液颜色变化，若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，若呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增)；B.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA用超纯水进行倍比稀释，然后按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测，评价所检测基因的敏感性；C.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，张轶静，姚毅，尚荣华，
申请(专利权)人：湖北医药学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42