本发明专利技术公开了一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物及其方法，所述引物包括序列号为SEQ ID NO.1的DNIFNA‑F和序列号为SEQ ID NO.2的DNIFNA‑R。所述方法包括：(1)提取待测样品的总基因组DNA；(2)采用所述引物对步骤(1)中提取的总基因组DNA进行PCR扩增；(3)对步骤(2)扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术通过设计一对特异性PCR引物，对待测样品通过一次PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测是否有条带，从显示判定扩增效果，且所用的模板可从动物肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度。
Primer for amplifying avian IFNA gene CDS sequence and method thereof
The invention discloses a primer for amplification of the avian IFNA CDS sequences and its method, the primers include sequence number SEQ ID NO.1 DNIFNA F and the serial number is SEQ ID NO.2 DNIFNA R. The method comprises the following steps: (1) the total genomic DNA was extracted from the sample; (2) using the primers of step (1) extraction of total genomic DNA was amplified by PCR; (3) to step (2) amplified products were detected by agarose gel electrophoresis. The present invention by designing a pair of specific PCR primers to the sample through a PCR amplification by agarose gel electrophoresis to detect whether there is a band from the display to determine the amplification effect, and the template can be extracted from animal muscle tissue, greatly reduces the difficulty of sampling.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物及其方法。
技术介绍
IFNA基因(interferonalpha)CDS干扰素-α。干扰素(interferon，IFN)是一类在特定诱导剂(细菌、病毒等)作用下产生的一类具有抗病毒[1]、抗肿瘤[2]、免疫调节[3]等生物学功能的细胞因子，是由Isaacs等在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的干扰现象时发现。根据氨基酸的序列、干扰素的功能及相应受体的结合，可将干扰素分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-τ、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ξ。Ⅱ型干扰素包括IFN-γ，Ⅲ型干扰素包括IL-28A、IL-28B、IL29。干扰素-α是由脊椎动物细胞受到病毒侵染时，由白细胞产生的一种调节蛋白，主要作用是抗病毒。在人和小鼠中，IFNA基因分别位于9号染色体的短臂和4号染色体的着丝粒近端区域。在原鸡中，IFNA位于Z染色体上。目前，NCBI上已释放鸟类IFNA序列较少，而诸多鸟类基因组注释尚不完整，从基因组中获取IFNA基因序列有限，所以亟需丰富鸟类IFNA基因的序列信息，以为研究鸟类干扰素抗病毒机制研究提供理论基础。雁形目鸟类属于水禽，我国是水禽养殖大国，近年来受禽流感疫情等影响，各种禽类疾病成为阻碍水禽发展的重要因素。鉴于干扰素-α广谱的抗病毒作用，因此对雁形目鸟类IFNA抗病毒机制和应用的研究迫在眉睫。而目前关于雁形目鸟类IFNA，特别是CDS区的分子数据较少。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物及其方法，目的是快速、准确的获取鸟类的IFNA基因CDS序列。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物，所述引物包括序列号为SEQIDNO.1的DNIFNA-F和序列号为SEQIDNO.2的DNIFNA-R。优选的，所述鸟类为雁形目鸟类。一种利用所述引物扩增鸟类IFNA基因CDS序列的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品的总基因组DNA；(2)采用所述引物对步骤(1)中提取的总基因组DNA进行PCR扩增；(3)对步骤(2)扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增采用12.5uL体系:ddH2O6.985uL，10×Ex-taqbuffer1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，DNIFNA-F(5umol/L)1.1uL，DNIFNA-R(5umol/L)1.1uL，Ex-taq(5U/uL)0.065uL。PCR反应体系为：95℃预变性5min。然后进行36个循环，该循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。通过对雁形目四个属七种鸟类采用本专利技术的方法实验，通过琼脂糖凝胶电泳图可以看出，对应PCR产物泳道均有条带。在本专利技术中，出现的7条条带中，所含有的DNA片段的长度大致相等，在750bp-1000bp之间。为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，同时节约成本，以12.5ul的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为1.1ul，DNA模板的用量为1ul。其中，用于PCR扩增的聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本专利技术在此不再详细赘述。所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为55℃，退火时间为30s。另外，对于PCR扩增中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均为本领域常规的设置，本专利技术在此不再详细赘述。本专利技术有益效果是:本专利技术通过设计一对特异性PCR引物，对待测样品通过一次PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测是否有条带，从显示判定扩增效果，且所用的模板可从动物肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可简便快速获取雁形目七种鸟类IFNA基因序列，从而达到简便易行，经济实用的目的。为深入研究雁形目鸟类干扰素抗病毒机制研究提供理论基础。附图说明下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：图1是本专利技术雁形目七种鸟类PCR扩增后琼脂凝胶电泳图。其中，泳道1来自斑嘴鸭肌肉样品、泳道2来自白额雁的肌肉样品、泳道3来自翘鼻麻鸭的肌肉样品、泳道4来自鸿雁的肌肉样品、泳道5来自赤麻鸭的肌肉样品、泳道6来自大天鹅的肌肉样品、泳道7来自豆雁的肌肉样品，泳道0为分子量标记。具体实施方式下面通过对实施例的描述，对本专利技术作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。需要阐明的是，所述引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成且引物浓度为5umol，本专利技术中使用的dNTPMix为Takara公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。样品取材：雁形目四个属七种鸟类：1只斑嘴鸭(鸭属)，1只赤麻鸭(麻鸭属)，1只翘鼻麻鸭(麻鸭属)，1只大天鹅(天鹅属)，1只鸿雁(雁属)、1只豆雁(雁属)、1只白额雁(雁属)。实施例11)总基因组的提取：采用酚-氯仿抽提法，取约100mg肌肉组织样本，剪碎后置于一只已灭菌的2.0ml的EP管；2)在EP管中加入1ml的DNA提取液及4ul20mg/ml的RNaseA(核糖核酸酶)，摇匀后置于37℃水浴锅中水浴1h；3)取出EP管，加入5ul20mg/ml的蛋白酶K，摇匀后置于37℃水浴锅中水浴约2-3h，直至肌肉完全消化，期间每隔10min上下摇匀；4)取出EP管，待冷却至室温后，加入等体积的饱和酚，温和上下摇匀约7分钟直至水相与酚相混合成乳状液；5)10000rPm，10℃下离心15min，取出上层水相至另一20mlEP管中；6)重复酚提取一二次；7)加入等体积的CI(氯仿异戊醇)，温和上下摇匀约7min，10000rPm，10℃下离心15min，取出上层水相至另一2.0mlEP管中；8)再次加入等体积的CI和上下摇匀约7min，10000rPm，10℃下离心15min，取出上层水相至另一1.5mlEP管中(分装到2管中，每管300ul)9)加入1/5体积的3mol/lNaAC及2倍体积预冷的无水乙醇，室温轻摇EP管置于-20℃冰柜中冷冻3h；10)从冰柜中取出EP管，12000rPm，4℃离心15min，并弃上清；11)加入500ul75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃离心15min，并弃上清；12)再加入500ul75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃离心15min，并弃上清，后风干沉淀；13)加入100ul1×TE溶解DNA；14)取2ulDNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳；15)总DNA置于-40℃冰柜中储存。以七种雁形目鸟类的总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增采用12.5uL体系:ddH2O6.985uL，10×Ex-taqbuffer1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，DNIFNA-F(5umol/L)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述引物包括序列号为SEQ ID NO.1的DNIFNA‑F和序列号为SEQ ID NO.2的DNIFNA‑R。
【技术特征摘要】
1.一种用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述引物包括序列号为SEQIDNO.1的DNIFNA-F和序列号为SEQIDNO.2的DNIFNA-R。2.根据权利要求1所述用于扩增鸟类IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述鸟类为雁形目鸟类。3.采用权利要求1或2所述引物在鸟类IFNA基因CDS序列测序中的应用。4.一种利用权利要求1或2所述引物扩增鸟类IFNA基因CDS序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品的总基因组DNA；(2)采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：阚显照，章勤，丁恒武，王莹，王青青，蒋澜，吴璇，易双龙，陈仁瑞，宛凤英，王会梅，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。