对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法技术

本发明专利技术提供在PCR法中抑制非特异性扩增的方法。本发明专利技术为一种PCR法，其是利用正向引物和反向引物对模板双链DNA中的所需目标序列进行扩增的PCR法，其特征在于，在所述PCR溶液中含有寡核酸A和寡核酸B中的至少任一种，所述寡核酸A是结合在所述模板双链DNA中所述正向引物所结合的单链DNA上、其结合位置比所述正向引物更靠3′侧下游且为目标序列的外侧、不会成为利用DNA聚合酶的延伸反应的起点；所述寡核酸B是结合在所述模板双链DNA中所述反向引物所结合的单链DNA上、其结合位置比所述反向引物更靠3′侧下游且为目标序列的外侧、不会成为利用DNA聚合酶的延伸反应的起点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法。
技术介绍
图I所示的聚合酶链反应(以下称作“PCR”)是对由第I单链DNA6和第2单链DNA7构成的双链DNA中所含的目标序列I进行扩增的代表性方法。以下一边参照图I 一边简单地说明PCR法。第I单链DNA6由3 ’末端-第I非扩增序列6a_单链目标序列Ia-第2非扩增序 列6b-5’末端构成。第2单链DNA7由5’末端-第3非扩增序列7a-互补性单链目标序列Ib-第4非扩增序列7b-3’末端构成。互补性单链目标序列lb、第3非扩增序列7a和第4非扩增序列7b分别与单链目标序列la、第I非扩增序列6a和第2非扩增序列6b互补。首先，将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、双链DNAl、正向引物4和反向引物5混合，制备混合液。正向引物4由具有5 20个碱基的核酸构成、且与单链目标序列Ia的3’末端部分6c互补。反向引物5由具有5 20个碱基的核酸构成、且与互补性单链目标序列lb’的3’末端部分互补。因此，正向引物4和反向引物5分别结合在3’末端部分6c和3’末端部分7c。接着，将该混合液在94°C 100°C下从I秒钟开始加热100秒钟，之后在50 70°C下从I秒钟开始冷却100秒钟。反复进行加热和冷却，获得扩增双链DNA序列2。扩增双链DNA序列2由与单链目标序列Ia相同的扩增单链目标序列6g和与互补性单链目标序列Ib相同的扩增互补性单链目标序列7g构成。专利文献f 3可以与本专利技术相关。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平5-199900号公报专利文献2 :日本特表2003-534772号公报专利文献3 :日本特表平3-508636号公报(特别是图3、图12)
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题如图I所示，当第I非扩增序列6a含有与单链目标序列Ia的3’末端部分6c相同的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还结合在该序列6d上。当第I非扩增序列6a含有与单链目标序列Ia的3’末端部分6c相类似的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还会错误地结合在该序列6d上。因此，所得的扩增双链DNA序列不仅包含所期望的扩增双链DNA序列2、还包含不希望的扩增双链DNA序列3。该扩增双链DNA序列3是非特异性扩增的产物，由不希望的扩增单链DNA3a和扩增互补性单链DNA3b构成。本专利技术的目的在于提供能够抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生的扩增方法。用于解决技术问题的手段解决上述课题的本专利技术是对由第I单链DNA和第2单链DNA构成的双链DNA中的双链目标序列进行扩增的方法，其中，所述双链目标序列由单链目标序列(Ia)和互补性单链目标序列(Ib)构成，所述第I单链DNA由3’末端-第I非扩增序列(6a)_所述单链目标序列(Ia)-第2非扩增序列(6b) -5’末端构成， 所述第2单链DNA由5’末端-第3非扩增序列(7a)-所述互补性单链目标序列(Ib)-第4非扩增序列(7b)-3’末端构成，所述互补性单链目标序列(lb)、第3非扩增序列(7a)和第4非扩增序列(7b)分别与所述单链目标序列(lb)、所述第I非扩增序列(6a)和第2非扩增序列(6b)互补，所述方法是将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、所述双链DNA (6、7 )、正向引物、反向引物和第I阻碍核酸(20)混合，使用聚合酶链反应对所述双链目标序列进行扩增的工序A，其中，所述正向引物和所述反向引物均作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，所述正向引物与所述单链目标序列(Ia)所含的3’末端侧的序列的部分互补，所述反向引物与所述互补性单链目标序列(Ib)所含的3’末端侧部分的序列互补，所述第I阻碍核酸(20)不会作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，所述第I阻碍核酸(20)与所述第3非扩增序列(7a)的一部分互补。专利技术效果可以抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生。附图说明表示以往PCR的图表示本专利技术的PCR的图接图2、表示本专利技术的PCR的图接图3、表示本专利技术的PCR的图接图4、表示本专利技术的PCR的图接图5、表示本专利技术的PCR的图表示以往PCR的图接图7、表示以往PCR的图接图8、表示以往PCR的图接图9、表示以往PCR的图接图10、表示以往PCR的图表示实施例I的电泳时的结果的图表表示比较例I的电泳时的结果的图表对实施例I和比较例I中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表表不实施例2的电泳时的结果的图表表示比较例2的电泳时的结果的图表对实施例2和比较例2中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表表示实施例3的电泳时的结果的图表表示比较例3的电泳时的结果的图表 对实施例3和比较例3中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表具体实施例方式以下一边参照图2 图11 一边说明本专利技术的方法。(实施方式)本专利技术通过在使用聚合酶链反应扩增双链目标序列I时添加第I阻碍核酸20而被赋予特征。第I阻碍核酸20不会作为用于利用DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用。优选阻碍核酸为合成寡核酸。第I阻碍核酸20的例子有经修饰的DNA、经修饰的锁定核酸(以下记为“LNA”)和肽核酸(以下记为“PNA”)。核酸是由糖、磷酸基和碱基构成的核苷酸通过磷酸酯键连接而成的生物体高分子。位于经修饰的DNA和LNA的3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰。PNA不需要该修饰。正向引物4与单链目标序列Ia的3’末端部分6c互补。因而，如图2所示，正向引物4结合在该3 ’末端部分6c。进而，正向引物4包含在第I非扩增序列6a中，也可结合在与单链目标序列Ia相同或类似的序列6d上。反向引物5与互补性单链目标序列Ib的3’末端部分互补。因此，如图2所示，反向引物5结合在该部分。阻碍核酸20与第3非扩增序列7a的一部分互补。因此，如图2所示，阻碍核酸20与第3非扩增序列7a的该部分相结合。当开始PCR时，如图3所示，DNA从正向引物4的3’末端和反向引物5的3末端’开始延伸，形成第I复制序列6el、第2复制序列7e和第3复制序列6e2。第I复制序列6el与通过将单链目标序列Ia和第2非扩增序列6b连续地连接所形成的序列互补。第3复制序列6e2与通过将第I非扩增序列6a的一部分、单链目标序列Ia和第2非扩增序列6b连续地连接所形成的序列互补。阻碍核酸20将反向引物5的DNA延伸停止。因此，第2复制序列7e与通过将互补性单链目标序列Ib和第3非扩增序列7b的一部分连续地连接所形成的序列互补。但是，第2复制序列7e不含有与从结合有阻碍核酸20的第2单链DNA7的部分至5’末端侧的序列相互补的序列7h。当进一步进行PCR时，如图4所示，正向引物4结合在第I单链DNA序列6和第2复制序列7e上。反向引物5结合在第2单链DNA序列7、第I复制序列6el和第3复制序列6e2上。阻碍核酸20也结合在第3非扩增序列7a和第3复制序列6e2上。之后，如图5所示，DNA从2个正向引物4的3’末端开始延伸，形成第I复制序列6el和扩增互补性单链目标序列7g。DNA从3个反向引物5的3’末端开始延伸，形成I条扩增单链目标序列6g和两条第2复制序列7e。扩增单链目标序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：林美穗，夜久英信，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：