本发明专利技术公开了一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法，利用单脱碱基双标记荧光探针的区分作用，结合内切酶IV和Lamdba外切酶的选择性切割作用，在温和条件下高灵敏度、高选择性、快速地检测DNA目标序列。本发明专利技术方法能够区分目标序列与单碱基差异干扰序列，适合应用于SNP分型以及低丰度突变的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA序列检测领域，包括核酸信号放大、单核苷酸多态性(SNP)分型以及低丰度点突变检测等
具体来说，涉及利用内切酶IV/Lambda外切酶复合酶体系与单脱碱基探针的一种放大体系，实现温和条件下高灵敏度、高选择性、快速地检测目标DNA序列。
技术介绍
核酸信号放大技术近几年取得了迅速的发展，分别建立了以限制性内切酶、核酸外切酶III和DNA酶为基础的信号放大方法。这类技术的检测工具都是DNA探针，理论上有希望应用于生命体系中进行原位、活体检测。另一方面，放大过程一般为恒温，操作较为简便。因而，核酸信号放大技术较PCR有一定的优势。但是，目前发展的一些信号放大方法，灵敏度不够理想，比PCR低4-5个数量级，而特异性方面表现也较为一般对于单碱基错配的区分并不明显。所以，这些信号放大方法的主要应用依旧局限于偶联其他检测体系，为这些检测体系放大检测信号。实际上，信号放大的优势并不仅仅在于提高信号相对于底物的比值，还可以用于放大信号差值如果DNA探针能够有效区分完全匹配与单碱基错配，那么信号放大技术则可以有效的将这个差异放大，从而被仪器检测到。对于SNP分型和低丰度突变检测来说，最关键的环节就是区分完全匹配与单碱基错配的信号。所以，特异性高、普适性好的信号放大技术能够方便的应用于这两个领域，而且与已有检测方法相比，信号放大技术有操作简单，容易设计等优点。因此，迫切需要开发具有高选择性的信号放大体系，将信号放大技术的优点应用于SNP分型以及低丰度突变的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种可以在温和条件下(例如37°C的生理温度条件下)选择性放大目标DNA序列信号的放大体系，从而实现高选择性、高灵敏度、易操作的DNA检测。内切酶IV是一种脱嘌呤/嘧啶(AP)核酸内切酶，水解DNA上的完整AP位点(脱碱基位置)，切割5’端与AP位点相连的第一个磷酸二酯键，产生3’ -OH和5’ -P末端，其最适工作温度为37°C。Lamdba外切酶催化双链DNA分子从5’ -P末端进行逐步的水解，释放出5’ -单核苷酸，但不能降解5’ -OH末端。根据这两种酶的上述特性，本专利技术利用单脱碱基探针的区分作用，结合内切酶IV和Lamdba外切酶的切割作用，采用如下技术方案，对DNA目标序列进行信号放大和检测。设计单脱碱基的双标记荧光探针，探针为5’ -OH末端的单链DNA，脱碱基位置(AP位点)位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游(可以在探针链的中部或3’末端)，二者之间相隔三个核苷酸残基以上。将该探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C的检测温度下，如果待测体系中存在能与所述探针特异性结合的DNA目标序列，则探针与该目标序列所形成的双链DNA中的脱碱基空位被内切酶IV识别并切割，结合于目标序列上的探针被内切酶IV切割为3-6 nt的短链和剩余的长链，3-6 nt的短链会从目标序列上解离下来，与目标序列保持结合的剩余长链的5’-P末端则引发Lamdba外切酶的进一步切割，当荧光基团或猝灭基团标记的核苷酸残基被切割后，荧光集团与猝灭基团远离，荧光共振能量转移(FRET)被破坏，从而发出荧光信号，而探针剩余片段的核苷酸残基被Lamdba外切酶逐个水解，释放出的目标序列依旧完好，可以继续与另一个探针特异性结合，再次引发上述反应；重复上述过程，实现目标序列的信号放大和检测，所检测到的荧光强度越高表明待测体系中目标序列的含量越高。 进一步的，本专利技术在研究过程中还发现了一个重要现象参见图1，除AP位点外，当DNA目标序列与探针有一个碱基错配，且该错配位于探针AP位点的3’下游第一个碱基位置时(定义该位置为I号位点，定义探针AP位点3’下游第二个碱基位置为2号位点，3号位点、4号位点等等依此类推)，所述信号放大过程得到加速，即荧光上升速率大于DNA目标序列与探针完全匹配的情况。另一方面，当DNA目标序列与探针在3号位点错配时，信号放大过程得到较大程度抑制；如果目标DNA序列与探针在1、3号位置同时错配时，信号放大过程受抑制程度更高，荧光上升非常缓慢。根据上述现象的启发，探针具体设计时有如下原则I.当DNA目标序列没有受到其他DNA序列的干扰时(这里的干扰性DNA序列特指与DNA目标序列仅有一个碱基不同的序列，记作“单碱基差异干扰序列”)，可以将探针在I号位点设置成与目标序列错配，其他部分除AP位点外完全匹配，以加速放大过程，提高灵敏度。2.当DNA目标序列与单碱基差异干扰序列同时存在时，首先确定目标序列与干扰序列的差异碱基，并找到探针与差异碱基对应的配对碱基的位置，然后将探针的脱碱基位点设计在差异碱基配对位点的5’上游第四个碱基处。这样，探针与目标序列或者干扰序列结合后，差异碱基位置就刚好处在探针的3号位点。另一方面，将探针3号位点设计成与目标序列匹配，自然，探针在3号位点与干扰序列是错配的。同时，故意设计探针I号位点的碱基与目标序列错配，由于干扰序列与目标序列仅在3号位点有一个碱基是不同的，因而探针与干扰序列在I号位点同样是错配的。总的来看，这样设计造成的结果是探针与目标DNA序列在I号位点错配，信号放大过程得到加速；而探针与单碱基差异干扰序列在1、3号位点同时错配，信号放大过程得到极大的抑制。事实上，上文所述DNA目标序列与单碱基差异干扰序列在临床上是很常见的单核苷酸多态性(SNP)中各种基因型之间的关系就是这样的。此外，DNA发生点突变时，突变型与野生型的关系同样如此。因此，本专利技术的方法可以用于SNP分型与低丰度突变基因的检测。SNP分型与低丰度突变检测唯一的不同在于SNP分型时，样品仅含有其中一种基因型，而进行低丰度突变检测时，样品中同时含有突变型序列和野生型序列，且突变型丰度较低，有些甚至低于I %。因此，可以说，能够进行SNP分型的办法不一定能够进行低丰度突变的检测，而能够进行低丰度突变检测的方法一定能够用于SNP分型。下面以低丰度突变检测为例，进一步说明本方法的原理将突变型视为目标序列，野生型视为单碱基差异干扰序列，然后按照上文所述原则2设计探针。于是，探针与突变型序列在I号位错配，探针与野生型序列在1、3号位错配。探针与样品混合后，突变型序列的信号得到快速的放大，而野生型序列的信号上升很缓慢，这样，即使突变型序列的丰度很低，依然可以通过快速放大其信号而检测到它。因此，在本专利技术的一方面，针对待测体系中不存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列的情况，本专利技术提供了如下对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法I)制备单脱碱基双标记荧光探针，该探针为5’_0H末端的单链DNA，其脱碱基位置(AP位点)位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列完全匹配互补，或者仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置与目标序列错配；2)将步骤I)制备的探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37°本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法，所述待测体系中不存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列，该方法包括如下步骤 1)制备单脱碱基双标记荧光探针，该探针为5’-OH末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列完全匹配互补，或者仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置与目标序列错配； 2)将步骤I)制备的探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C进行实时荧光测定所述探针与待测体系中的目标序列特异性结合，经内切酶IV和Lamdba外切酶切割后发出荧光，释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，从而实现对目标序列的信号放大和检测。2.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法，所述待测体系中可能存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列，该方法包括如下步骤 1)制备单脱碱基双标记荧光探针，该探针为5’-0H末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置错配，而与干扰序列在脱碱基位置3’下游第一和第三两个碱基位置错配； 2)将步骤I)制备的探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37°C进行实时荧光测定所述探针与待测体系中的目标序列特异性结合，经内切酶IV和Lamdba外切酶切割后发出荧光，释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，荧光信号快速上升；而所述探针与待测体系中的干扰序列特异性结合后，荧光信号上升受到抑制；从而实现对目标序列的信号放大和检测。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，在所述探针上，荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在探针的中部或3 ’末端。4.如权利要求I或2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵美萍，肖先金，张晨，苏昕，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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