扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物技术

本发明专利技术公开了一种特别适合于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所述的引物具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的序列。所述的引物适用于多种类型的单克隆抗体重链可变区的扩增，包括ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ等抗体亚型。本发明专利技术还公开了一种获得单克隆抗体重链基因的方法。

Method for amplifying antibody heavy chain leading sequence and variable region gene sequence and primer thereof

The invention discloses a primer which is especially suitable for amplifying a monoclonal antibody heavy chain gene, and the primers have a sequence shown by SEQ, ID, NO:1 or SEQ ID NO:2. The primers are suitable for the amplification of heavy chain variable regions of various types of monoclonal antibodies, including IgG1, IgG2a, IgG2b and other antibody subtypes. The invention also discloses a method for obtaining a monoclonal antibody heavy chain gene.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种扩增重链前导序列 及可变区基因序列的方法及引物。
技术介绍
单克隆抗体作为一种新型生物制剂在人类疾病的预防、诊断和治疗方面已 显示出重要的作用。但是由于单克隆抗体大都来自于鼠源，鼠源性单抗属于异 种蛋白而具有免疫原性，故在人体内产生不同程度的人抗鼠抗体(HAMA)反应， 从而削弱其治疗的有效性，并对清除抗体的器官产生损害。并且在人体中常不 能有效地活化补体和Fc受体相关的效应系统，因此其在人体内重复应用具有一 定局限性。为了克服这些鼠源单抗的缺点，基因工程抗体技术应运而生。它是 在基因水平上，对抗体进行改造，或者构建完全新型的抗体。基因工程抗体主 要包括嵌合抗体，人源化抗体及一些小分子抗体，如Fab, scFv等。嵌合抗体是人源化抗体的最早形式。在嵌合抗体的构建过程中，准确地克 隆鼠抗体的信号肽和可变区基因是最为重要的。在B细胞发育过程中重链可变 区基因首先重排，然后是轻链可变区基因。最后每个B细胞只含有一个功能性 重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，每个这样的B细胞产生一种 特异性抗体。重链可变区基因重排包括D-J重排和V-DJ重排两个独立的过程， 可有8262种组合；轻链可变区基因的重排包括V-J重排，可有320种组合。因此， 相对于轻链可变区来说，重链可变区的多样性更高，扩增的难度更大。近年来，由于分子生物学技术的发展，PCR技术已被广泛用于克隆VH或 VL基因。根据小鼠Ig重链和轻链V区基因5'端及3'端相对保守的特点，可以设 计相应的引物通过反转录PCR来扩增重链及轻链的相应功能区。目前，根据5' 端引物配对的位置不同，扩增鼠抗体可变区基因的简并引物设计方式主要分为 两种 一种是抗体重链和轻链V区5'端引物与V区的前导序列互补，重链V区3'4端引物与IgG CH1 5'端及所有V区J段3'端互补，轻链V区3，端引物与K链CL5' 端和轻链V区的所有J段3，段互补；另一种引物分别与抗体可变区基因骨架区 FR1和FR4互补。上述第一种引物的简并性基本不会造成PCR产物与原基因序列 上氨基酸的差异，但由于前导序列变化较大，引物设计难度高，往往得不到所 需的扩增产物；而第二种引物因为其简并性，有可能造成抗体氨基酸的变异或 缺失，这种差异可能会导致构建的嵌合抗体的亲和力等功能的降低。由于目前 抗体基因库的资料有限，因此这些比较常见的引物可能不适用于扩增一些特殊单抗的基因。鉴于以上问题，近年来出现的RACE技术具有省时、灵敏和高效的特点。 RACE(rapid amplification cDNA end)即cDNA克隆法或快速扩增cDNA末端法。 5'RACE是以PCR技术为基础，使用01igo(dT)对mRNA进行反转录后，再用脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)给cDNA的5'端进行同聚物加尾反应，从而在未知 的cDNA的5'端加上一段linker，然后再用基因特异引物和linker引物经PCR扩增 未知mRNA的5'端。采用5'RACE的方法可以得抗体的可变区及信号肽的真实序 列，继而保证通过基因工程改造得到的抗体的功能。然而要成功应用这种方法 还有许多技术上的难题。首先，在3个连续的酶促反应(反转录、TdT加尾、PCR 扩增)步骤中，每一个步骤的失败都会导致实验完全或部分失败；其次，即使3 个酶促反应均能顺利进行，但其结果也通常会出现一些非特异产物或非全长的 产物背景，对基因特异引物的设计要求很高。随着RACE技术日益完善，目前 己有商业化RACE技术产品推出，其中以CLONTECH的MarathoTM技术和 SMART TMRACE技术为代表。但是这些商业化的产品的操作繁琐，实验周期 较长，而且成本高昂，成功率也不很理想，均不太适合用来扩增抗体的可变区 序列。因此，本领域迫切需要开发操作简便、成本低廉、效果优异的扩增抗体可 变区序列的方法及产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方法适 用于多种类型的单克隆抗体的重链扩增，操作简便，成本低廉。本专利技术的另一目的在于提供用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，以及含 有所述引物或其它相关试剂的试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方 法包括(1) 以SEQIDNO: l所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行 反转录，获得cDNA;(2) 在反转录获得的cDNA的3'末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是 选自A、 T、 C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；(3) 以SEQ ID NO: 2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行 PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、 T、 C或G之一且与N互补配对的碱 基，M的个数是10-40个；和(4) 从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。在一个优选例中，N是选自C或G的碱基。更佳的，当N选择C或G时，N或 M的个数是10-40个；较佳的，N或M的个数是15-30个，如15个。在另一优选例中，当N选择A或T时，N的个数是50-120个；较佳的，N的个 数是70-100个，如80个。M的个数是10-40个，较佳的为10-30个，更佳的为15-30个。在另一优选例中，在步骤(3)中，PCR扩增的热循环过程中，退火温度是 60-65 。C(更佳的是62-63X:)。在另一优选例中，还包括步骤对获得的抗体重链基因进行测序，从而获 得单克隆抗体重链基因的序列。在另一优选例中，所述的单克隆抗体是(但不限于)IgGl， IgG2a或IgG2b型。在另一优选例中，所述的杂交瘤细胞是鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成的 杂交瘤细胞。在另一优选例中，所述的鼠是小鼠。在另一优选例中，所述的单克隆抗体重链基因包括抗体重链的前导序列和 可变区基因。在本专利技术的第二方面，提供一种用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所 述的引物具有选自下组的序列SEQIDNO: l所示的序列，或SEQ ID NO: 2所示的序列。在本专利技术的第三方面，提供一种扩增单克隆抗体重链基因的试剂盒，所述的试剂盒中含有引物，所述的引物具有SEQIDNO: 1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列。在另一优选例中，所述试剂盒中还含有同聚物加尾试剂，用于在反转录 产物中cDNA的3'末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、 T、 C或G 之一的碱基，N的个数是5-120个；和/或多聚M引物，M是选自A、 T、 C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数 是10-40个。在另一优选例中，所述试剂盒中还含有 PCR扩增试剂；和/或 RNA提取试剂；和/或 使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图1显示了利用SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3对同聚物加尾后的cDNAPCR扩增结果。其中泳道l.获自N-57-19(anti-VSV-G)的cDNA的扩增产物电泳结果； 泳道2.获自N-34-12(anti-IA-2)的cDNA的扩增产物电泳结果； 泳道3.获自S-42-27 (anti-BHLHB3-BSA)的cDNA的扩增产物电泳结果； 泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得单克隆抗体重链基因的方法，其特征在于，所述方法包括：　（１）以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示序列为引物，以杂交瘤细胞的ＲＮＡ为模板，进行反转录，获得ｃＤＮＡ；　（２）在反转录获得的ｃＤＮＡ的３’末端加上多聚Ｎ，获得加尾产物； 其中Ｎ是选自Ａ、Ｔ、Ｃ或Ｇ之一的碱基，Ｎ的个数是５－１２０个；　（３）以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示序列和多聚Ｍ为引物，以加尾产物为模板，进行ＰＣＲ扩增，获得扩增产物；其中Ｍ是选自Ａ、Ｔ、Ｃ或Ｇ之一且与Ｎ互补配对的碱基，Ｍ的个数是１０－ ４０个；和　（４）从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兵，王茜，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]