用于核酸的振荡扩增反应制造技术

本发明专利技术的一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法。该方法包括将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物含有与核酸靶序列的模板互补的引物。所述反应的温度在高温和低温之间振荡，其中在多个温度循环期间，温度的变化不大于约20℃。核酸靶序列的模板被扩增。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸的振荡扩增反应对相关申请的交叉引用本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸的振荡扩增反应”的美国临时专利申请号61／477,437的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸检测和鉴定的集成设备”的美国临时专利申请号61／477,357的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。关于联邦资助的研究或开发的申明不适用。在光盘上递交的材料的通过引用的结合不适用。授予版权的材料不适用。关于序列表、表格或计算机程序申请人在此递交序列表，其为文本文件，题为041812_ST25.txt，创建于2012年4月20日，具有10K千字节，符合ASCII，并且通过引用引入本文。专利技术背景专利
(
)：本专利技术的实施方案涉及通过在任意给定的热聚合循环期间使反应温度在小范围内振荡，优选地在不大于20℃的范围内振荡进行核酸靶序列的依赖于模板的扩增的方法和设备。
技术介绍
：注意，以下讨论引用多篇出版物和文献。本文中给出对这些文献的讨论是为了科学原理的更完全的背景，并且不被视为是承认这些出版物是用于确定专利性的现有技术。在分子生物学中核酸的扩增是最必不可少的技术之一，其在研究、遗传测试、农业和法医学中广为使用。最常见的扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其中，特异性核酸靶序列的优势在溶液中呈指数增加(参见美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR反应采用两种寡核苷酸引物，所述引物杂交待扩增的靶序列的上游(5’)或下游(3’)的DNA双螺旋的相反链。(通常热稳定的)DNA聚合酶用于在5’→3’方向通过添加脱氧核苷三磷酸(dNTPs)使杂交的引物延伸，以便“拷贝”靶序列并且产生双链DNA产物。通过循环反应混合物的温度(典型地摄氏95℃)，DNA的两条链可以在高温分离，这允许它们充当模板以用于进一步的引物结合以及在较低温度(例如55℃和60℃)聚合。在重复该过程多次后，单个靶序列可以被扩增成数十亿的拷贝。虽然PCR是装备精良的实验室中的金标扩增方法，但是它相当复杂，需要具有主动加热和冷却加热元件和精确温度控制的昂贵且复杂的热循环装置，并且需要训练有素的技术人员收集有意义的结果。例如，大多数PCR反应需要在至少两个温度（例如95度和57度)之间的快速且精确的循环，这典型地导致使用昂贵和效能低的Peltier发动机(热电冷却机制)和精确的温度控制元件。这样的固有限制使得PCR不适宜于开发具有成本效益的、护理位点(point-of-care)的核酸诊断(这在缺乏支持性实验室基础设施的情况中是有用的)。为了排除一些PCR的大量资源需求，在过去数十年中开发了多种“等温”扩增技术。在这样的反应中，可以在单个温度扩增核酸，不需要昂贵的热循环仪，并且使得它们更适用于低成本诊断设备。实例包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，解旋酶介导的扩增，链置换扩增，环介导的等温扩增(LAMP)等。然而，这些等温扩增方法通常需要60-90分钟的扩增时间(由于缓慢的体外动力学酶促过程所致)和在单一温度点的精确的温度控制以适应极端严格的扩增反应，同样缺少当场诊断应用所需的稳健性和速度。依赖模板的核酸扩增是基于核酸的分子诊断的基础。在卫生保健、农业中，以及在生物学领域和战争的情境中，急切需要稳健的、低成本的、快速的、护理位点的核酸诊断。然而，与现有的PCR或等温扩增相关的测定化学策略具有显著的工程和稳健性限制，这使得这样的扩增方法昂贵且对于资源有限的情况(其中基于核酸的分子可以最大地影响紧急疾病预防和控制)是不实用的。必须对核酸扩增进行相当大的改进以为缺少专门实验室基础设施的情况提供可负担的且稳健的诊断。常规PCR依赖高特异性和快速热循环，通常使温度变化多达40℃。这样的扩增方法需要昂贵的仪器以便快速地加热和(尤其地)冷却PCR反应混合物，此外还要精确地保持溶液温度。等温核酸扩增方法，虽然不需要复杂的热循环装置，但是通常是缓慢的(至少60分钟的反应时间)，不可靠的，并且需要精确的温度校准。在PCR热循环方法中，PCR循环仪必须具有良好的温度控制以保持样品内的温度均匀性和至少2℃／秒的典型的样品加热（和／或冷却)速率。温度控制典型地通过反馈回路系统实现，而温度均一性通过高导热性但是体积大的材料如铜实现。高加热速率通过执行比例积分微分(PID)控制方法实现，这受最大耗散功率和热容量的限制。高冷却速率相当难实现并且大体积系统需要借助热电元件(P.Wilding，M.A.Shoffner和L.J.Kricka，Clin.Chem.，1994，40，1815-1817.)(通常称为Peltier元件)或其他手段如水(J.B.Findlay，S.M.Atwood，L.Bergmeyer，J.Chemelli，K.Christy，T.Cummins，W.Donish，T.Ekeze，J.Falvo，D.Patterson，J.Puskas，J.Quenin，J.Shah，D.Sharkey，J.W.H.Sutherland，R.Sutton，H.Warren和J.Wellman，Clin.Chem.，1993，39，9，1927-1933)的强制冷却。这些PCR机是复杂且耗电量大的设备。因为系统体积大，所以其热时间常数是以分钟计而不是以秒计，这导致长的过渡时间和不需要的PCR副产物。高的能耗使得不可能制备电池供电的和便携的PCR系统。在基于硅技术的显微机械加工和生物学微电机系统(bioMEMS)有最近发展的情况下，全世界很多课题组已经开始开发microPCR(μPCR)，其是芯片实验室(1ab-on-a-chip)或微型全分析系统(μTAS)的中心部分。研究者遵循两个基本途径：使温度循环的固定系统，具有处于不同温度的三个区的流动系统。这两种系统都具有其优点和缺点。固定系统使腔室的温度循环以便改变PCR溶液的温度。其不需要泵送系统或其他用于来回移动PCR样品的装置。流通系统典型地具有处于三个恒定温度的区。样品仅通过在不同温度的区之间移动来改变温度。这种PCR系统比第一种更快速，但是它需要执行机制以来回移动样品。在两种情况中，加热器与PCR系统集成，所以丢弃设备以避免在仅进行单次测试后的交叉污染是不经济的。这两种形式展现的主要优点是：与常规设备相比，循环时间减少，并且使用的样品体积减小。然而，这些PCR芯片使用需要采用昂贵和复杂制造工艺的基质材料如硅，导致非常高的单价。此外，由于获得提高的表面／体积比所需的极小的反应体积(<μl)以及用于μPCR芯片的材料的类型，与常规PCR不甚相同的一些效果变得明显，这包括生物样品的非特异性吸附、抑制、样品蒸发和形成气泡。目前的其他努力还涉及开发温度循环反应微芯片，所述微芯片集成了固定室和连续流动PCR以进行流通微通道PCR芯片的有效温度循环，同时具有改变循环数和PCR芯片中的固定室中的温度区的数目的灵活性。然而，混合PCR设备的有效性仍然正在被确认，并且与所述μPCR芯片方法相关的涉及样品抑制、吸附和气泡形成的问题仍然给所有在前面的样品制备／核酸分离方法以及扩增试剂和反应条件(例如极高的聚合酶浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含与所述核酸靶序列的模板互补的引物；使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃；以及扩增所述核酸靶序列的模板。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.20 US 61/477,437;2011.04.20 US 61/477,3571.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含与所述核酸靶序列的模板互补的引物；使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于20℃；以及扩增所述核酸靶序列的模板，其中所述扩增反应混合物包含结合所述核酸的模板的相反链的引物对，其中所述扩增反应混合物包含核酸去稳定剂，所述核酸去稳定剂包含浓度为8-15体积％的DMSO、甲酰胺和/或甜菜碱。2.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于15℃。3.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于10℃。4.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于5℃。5.权利要求1的方法，其中一旦达到所述上限温度或所述下限温度，将所述温度保持在温度波动内一段时间。6.权利要求1的方法，其中一旦达到所述温度范围内的上限或下限温度，将所述温度变化为其它温度。7.权利要求1的方法，其中所述下限温度不小于50℃。8.权利要求1的方法，其中所述上限温度不大于85℃。9.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是单链DNA或RNA。10.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是双链DNA或RNA。11.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是RNA。12.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是DNA。13.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于1000bp。14.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于250bp。15.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于150bp。16.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于100bp。17.权利要求1的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥65℃。18.权利要求1的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥70℃。19.权利要求1的方法，其中所述引物对具有35-70个碱基对的长度。20.权利要求1的方法，其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃。21.权利要求1的方法，其中所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自具有40-47个碱基对的长度。22.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含引物或引物对，所述引物或引物对具有35-70个碱基对的长度并且与所述核酸靶序列的模板互补，并且其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃；浓度为8-15体积％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡红，内森·J·科布，
申请(专利权)人：梅撒技术国际公司，
类型：
国别省市：