利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增DNA分子的方法技术

本发明专利技术涵盖了一种恒温扩增特定序列的DNA分子的方法和流程。本发明专利技术是基于意外的发现，即本发明专利技术中的引物，在某些位置的核苷酸被非天然的核苷酸替代(“SAMRS核苷酸”)，例如：以2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代腺嘌呤，以肌苷替代鸟嘌呤，以2-硫代胸腺嘧啶替代胸腺嘧啶，以N4-乙烷基胞嘧啶替代胞嘧啶，这些含有SAMRS核苷酸的引物能够被常规的解旋酶恒温扩增法(HDA)中的酶所接受和使用。进一步意想不到的结果是，目标核苷酸(DNA/RNA)能够在解旋酶恒温扩增法(HDA)中被含有SAMRS核苷酸的引物有效地扩增放大。同时，我们还发现，通过使用SAMRS-取代的引物能够减少恒温扩增法中的非特异扩增和引物自聚的副产物。

Method for constant amplification of DNA molecule by nucleotide analogue and helicase

The present invention relates to a method and process for isothermal amplification of specific sequences of DNA molecules. The present invention is the unexpected discovery based on the primer of the invention, is a non natural nucleotide nucleotide substitution in certain locations (\SAMRS nucleotides\) for example: 2-, 6- two or 2 amino purine, amino purine substitution of adenine, inosine substitution to guanine, thymine thymine substituted with 2- s N4-, ethane based on these alternative cytosine cytosine containing SAMRS nucleotide primers can be amplified by the conventional constant temperature helicase (HDA) enzyme in the acceptance and use. Further unexpected results are that the target nucleotide (DNA/RNA) can be amplified and amplified by a SAMRS nucleotide primer in the helicase isothermal amplification method (HDA). At the same time, we also found that the use of SAMRS- instead of primers was able to reduce the non-specific amplification of the isothermal amplification method and the by-product of primer self polymerization.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
(1)本专利技术所涉及的
：本专利技术的
是核酸化学，具体地说是涉及扩增预选选定的DNA分子数量(“扩增”目标DNA序列)的领域，更具体地说，本专利的
覆盖恒温扩增流程和方法，这里的恒温扩增流程不需要传统聚合酶链式反应中使用的温度循环。(2)
技术介绍
描述在许多实际的应用方面，包括针对生物样品中DNA和RNA分子的诊断，“放大”特定的核酸序列是最直接的一种方法。传统上，这项诊断工作是通过聚合酶链式反应(PCR)来完成[R.K.Saiki,D.H.Gelfand,S.Stoffel,S.J.Scharf,R.Higuchi,G.T.Horn,K.B.Mullis,H.A.Erlich(1988)耐热性DNA聚合酶利用引物来扩增DNA分子。《科学》239,487-491]。在聚合酶链式反应里，一个“正向引物”经过退火而结合到预先选择的目标寡核苷酸序列以形成双链体。然后，DNA聚合酶将利用该引物和合适的2'-脱氧核苷三磷酸合成与目标寡核苷酸序列互补的寡核苷酸产物(采用沃森-克里克互补规则)；目标寡核苷酸和合成的寡核苷酸产物他们的序列互补，并且形成标准的DNA双螺旋结构。然后，双螺旋结构经过加热，通常在温度超过75℃时“熔化”得到两个序列互补的单链DNA分子。在超过75℃以上的温度，每一条单链DNA与其互补的DNA都是自由的。最初的目标分子，然后结合到第二个正向引物，同时产物DNA分子结合到一个“反向引物”，这个反向引物被设计成能够结合到产物DNA分子下游的一个特定的位点。然后，聚合酶继续利用引物进行复制和延伸，從而得到全长的双链DNA产物(现在产物的数量翻倍)。接下來，通过加热两条DNA链再次分离，从而更多的正向和反向引物经过退火与目标DNA分子结合。重复聚合酶链式反应，结果就可以产生大量目标DNA分子以及其互补序列的拷贝。在不对称聚合酶链式反应(PCR)中，目标DNA分子和它的互补序列的拷贝数目取决与正向和反向引物的比例。经典的PCR被广泛应用于研究、科学和技术等领域，并且被作为首选的方法来检测复杂生物样品中少量的DNA。然而，利用不同的温度循环以分离DNA双链体，在许多应用中有它的局限性，例如，常规的PCR技术和仪器很难被用在医生办公室和随时随地的目标DNA分子的即时检测。因此，大家希望不需要温度循环的扩增目标DNA分子的技术，这种恒温扩增的需求在很多的文献中被提及，其中也包括被称为“重组酶聚合酶扩增”的文献(RPA)[Piepenburg,O.,Williams,C.H.,Stemple,D.L.,Armes,N.A.(2006)利用重组酶和聚合酶扩增DNA。PLoSBiol4(7):e204],滚环法扩增(RCA)，NASBA，解旋酶协助的恒温扩增(HDA)[Tong,Y.,Lemieux,B.,；Kong,H.(2011)多种策略以改善灵敏度，速度和可靠的恒温核酸扩增法快速病原体检测。BMCBiotechnol.11Art.No:50][Lemieux,B.,Li,Y.；Kong,H.M.,Tang,Y.W.(2012)几乎不需要仪器的，简单和快速的检测单纯疱疹病毒的分子器件和方法：ExpertReviewMolec.Diagnostics12,437-443DOI:10.1586/ERM.12.34]和LAMP，等等。这些均被称为“恒温扩增”的方法。然而现在的恒温扩增方法常常表现欠佳。在许多情况下，扩增的效果似乎取决于特定的目标分子的序列，或在扩增过程中使用的探针和所使用的引物的序列。在某些情况下，恒温扩增会完全的失败。在许多情况下，除了目标分子的扩增产物以外，还会出现额外的“伪”产品。当试图在一个试管中同时等温扩增多个寡核酸样品时(“多重恒温扩增”)，这些伪产物更加容易产生。截止目前，基本上没有理论可以解释这些和其他易变的结果，虽然有一些公开的、私下的或非正式的猜测和解释，但是这些猜测和解释中有一些矛盾。其中一种解释伪产物的产生是因为在低度下，一些DNA分子(包括引物，探针，或被分析物)通过非沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用可能会形成其他的折叠方式，从而导致扩增过程的失败。其它的解释认为，要避免分子内或分子间的相互作用而产生非特异性扩增，高温退火是核苷酸扩增法中必须有的步骤。另外，引物与引物之间的相互作用经常被用来解释多种等温扩增系统失败的原因，尤其是在多重恒温扩增法中。到目前为止，以上的这些解释没有一个被完全确立。因此，在本领域中还没有明确的实验方法来试图克服这些问题，也没有可靠的程序来指导和执行用于所有目标序列的等温扩增法，尤其是，针对多重恒温扩增法扩增多个(多于一个)目标分子序列。解旋酶协助的恒温扩增法(HDA)尤其容易受到引物二聚等副产物扩增的影响。HDA使用称为解旋酶的蛋白酶来代替高温达到分离DNA双链结构。在理论上，解旋酶可以将双链DNA分开，从而允许引物结合到最初的双链DNA分子上，因此从最初的一个双链DNA分子产生两个双链DNA分子。虽然HDA技术已经成功的用于许多寡核苷酸的扩增，但遗憾的是，这个技术并不适用于扩增所有的目标寡核苷酸。同样地，当HDA扩增单个DNA分子时，副产物常常会引起等温扩增失败。多重恒温扩增技术，副产物产生的可能性更大，特别是多个引物之间的相互作用而产生引物二聚体和多聚体，因此多重恒温扩增法失败的几率特别大。不论在何种情况下，这些副产物的产生限制了这些技术的灵敏度和多重性。此外，标准的HDA技术无法使用引物浓度超过0.2微摩尔，这样就限制了检测的速度。专利技术的内容本专利技术是基于意外的发现，即本专利技术中的引物，在某些位置的核苷酸被非天然的核苷酸替代(“取代的引物”)，也就是引物中至少一些位置的A，T，G和C核苷碱基被本专利中设计的核苷类似物A*，T*，G*和C*取代(“SAMRS核苷酸”)，这些被SAMRS取代的引物能够被解旋酶和聚合酶接受，实现象HDA一样的恒温扩增。目前最优选的取代策略是以2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤(这两个核苷类似物均被定义为A*)替代腺嘌呤，以肌苷(定义为G*)替代鸟嘌呤，以2-硫代胸腺嘧啶(定义为T*)替代胸腺嘧啶，以N4-乙烷基胞嘧啶(定义为C*)替代胞嘧啶。进一步意想不到的结果是，目标核苷酸(DNA/RNA)能够在解旋酶恒温扩增法(HDA)中被含有核苷类似物(SAMRS)取代的引物有效地扩增放大。此外，本专利技术也是基于下述发现，即被SAMRS取代的引物进一步被人工扩展地遗传信息系统(AEGIS)中的核苷酸标记，SAMRS取代和AEGIS标记的引物也能够很好的被用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于合成DNA分子的流程，该DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目标DNA分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在缓冲水溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'‑脱氧核苷三磷酸，和含有非天然核苷酸的引物，该引物的序列与目标DNA分子的一个序列片段基本上互补，并且在该引物中至少一种腺嘌呤被2‑氨基嘌呤或2，6‑二氨基嘌呤替代，或者引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取代，或至少有一个胸腺嘧啶被2‑硫代胸腺嘧啶取代，或者至少一个胞嘧啶被N4‑乙烷基胞嘧啶所取代，并且其中所述被替换的核苷酸的数目总数是2至6。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.19 US 13/970,1111.一种用于合成DNA分子的流程，该DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目标DNA
分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在缓冲水
溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和含有非天然核苷
酸的引物，该引物的序列与目标DNA分子的一个序列片段基本上互补，并且在该引物中至少
一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取
代，或至少有一个胸腺嘧啶被2-硫代胸腺嘧啶取代，或者至少一个胞嘧啶被N4-乙烷基胞嘧
啶所取代，并且其中所述被替换的核苷酸的数目总数是2至6。
2.一种用于合成多个DNA分子的流程，这些DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目
标DNA分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在
缓冲水溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和两种含有
非天然核苷酸的引物，一种是正向引物和另一种是反向引物，所述正向引物的序列基本上
互补与目标DNA分子的一个片段，所述的反向引物的序列基本与目标DNA分子下游某段序列
相同，并且在每一种引物中至少一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者每
一种引...

【专利技术属性】
技术研发人员：史蒂文·奔纳，杨尊义，
申请(专利权)人：史蒂文·奔纳，杨尊义，
类型：发明
国别省市：美国;US