一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括RNA提取试剂、恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明专利技术的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；从病毒RNA逆转录到链置换扩增全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合现场快速检测使用。

【技术实现步骤摘要】
一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法(一)
本专利技术涉及一种针对扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对扎伊尔型埃博拉病毒的定性检测。(二)
技术介绍
埃博拉出血热是由埃博拉病毒感染引起的一种高度接触性烈性传染病，感染人类后可引起严重的急性出血热，易人传人，致死率高达70-90％。埃博拉病毒具有囊膜，基因组不分节段，为单链负股RNA，属于单负股病毒目丝状病毒科丝状病毒属。埃博拉病毒含有一个线性RNA基因组，长约19Kb，含有7个基因，依次编码核蛋白(NP)、病毒结构蛋白(VP35，VP40)、糖蛋白(GP)、额外病毒结构蛋白(VP30，VP24)、RNA依赖RNA聚合酶(L)。埃博拉出血热需要通过实验室手段确诊，常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规PCR、免疫荧光、荧光定量PCR和ELISA等。这些方法或是操作复杂，费时、费力，或是敏感度不够，需要特殊仪器设备等，不能快速获得结果，亟待需要一种快速、简单、准确的检测方法。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：(1)RNA提取试剂(优选德国QIAGENRNA提取试剂盒(Qia-74104))；(2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×ThermolBuffer、MgSO4、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸水；其中：所述的外围引物分别为：外围正向引物：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；外围反向引物：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；所述两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针：5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；反向5’端Fitc标记探针：5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；扩增反向引物：5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；(3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；(4)阴性对照：无菌双蒸水。进一步，本专利技术所述的1×Thermolbuffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH8.8。进一步，本专利技术所述阳性对照为含有长189bp的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下：TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。进一步，本专利技术所述阳性对照按如下步骤制备：以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒(Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，-20℃保存。进一步，本专利技术所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermolbuffer，MgSO4为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，BstDNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25μl。本专利技术还提供一种所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的应用，所述应用为：a)用试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取RNA；b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在58℃下扩增反应35分钟；阳性对照PCR管中加入阳性模板，阴性对照PCR管中加入阴性模板，所述阳性模板为含有扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的质粒，所述阴性模板为无菌双蒸水；c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时(即试纸条T线为红色，C线为红色)，说明样品中含有扎伊尔型埃博拉病毒核酸。所述核酸试纸条防污染检测装置中试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FitC抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FitC抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。在本专利技术提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。RNA由逆转录酶逆转录成cDNA后，本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本专利技术提供的扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本专利技术与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了扎伊尔型埃博拉病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100个拷贝，可以满足快速检测扎伊尔型埃博拉病毒的要求。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：(1)本专利技术所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；(2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；(3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。(四)附图说明图1为核酸检测试纸条原理示意图。图2为本专利技术试剂盒用于检测扎伊尔型埃博拉病毒的特异性，1-5依次为西尼罗热病毒；基孔肯雅热病毒；登革热病毒；阳性对照(102拷贝/反应)；空白对照。图3为本专利技术试剂盒用于检测扎伊尔型埃博拉病毒的灵敏度，1-5依次为104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应、101拷贝/反应、空白对照。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1本专利技术试剂盒的组成与配制a)RNA提取试剂：德国QIAGENRNA提取试剂盒(Qia-74104)；b)扎伊尔型埃博拉病毒核酸恒温PCR扩增反应液：两条外围引物(10pmol)，两条探针(20pmol)和两条交叉引物(40pmol)，1×Thermolbuffer，MgSO4(6mmol)，dNTPs溶液(各0.4mmol)，BstDNA聚合酶(8U)，AMV逆转录酶(5U)和无菌双本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：(1)RNA提取试剂；(2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO4，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为：5′‑TGGTTCAAGTGCACAGTCAA‑3′；反向外围引物为：5′‑TGTCTGCTCTACGGTGATGT‑3′；所述两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5′‑Biotin‑GCAAGGGTTGTCAGATGCG‑3′；反向3’端FitC标记探针5′‑Fitc‑ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC‑3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′‑AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT‑3′；扩增反向引物：5′‑CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG‑3′；(3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；(4)阴性对照：无菌双蒸水。

【技术特征摘要】
1.一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：(1)RNA提取试剂；(2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物，反向外围引物，两条探针，两条扩增交叉引物，1×ThermolBuffer，MgSO4，dNTPs溶液，BstDNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；反向外围引物为：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；所述两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；扩增反向引物：5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；(3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；(4)阴性对照：无菌双蒸水；所述1×ThermolBuffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH8.8。2.如权利要求1所述扎伊尔型埃...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐昌平，卢亦愚，冯燕，陈寅，高见，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33