同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法技术方案

本发明专利技术涉及用于在能够引起感染的许多可能病原体中鉴别眼睛和中枢系统感染的单种病原体或一种以上病原体的诊断方法。所有感染眼睛或中枢系统的个别区域的病原体一般引起相同的表现或症状，本发明专利技术涉及以单一的检验在这组可能的病原体中检测或鉴别到该病原体，而不需要借助于各针对每一种病原体的检测的成套检验。本发明专利技术致力于用基于症状的诊断替代基于个别病原体检测的诊断。

【技术实现步骤摘要】
同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法本申请是申请日为2008年05月27日和专利技术名称为“同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法”的200880000035.8号专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及用于在能够引起感染的许多可能病原体中鉴别眼睛和中枢系统感染的致病的单种病原体或一种以上病原体的诊断方法。所有影响眼睛或中枢系统的个别区域的病原体一般引起相同的表现或症状。本专利技术涉及以单一的检验在这组可能的病原体中检测和鉴别该病原体，而不需要借助于一种病原体一种检测的成套检验。本专利技术致力于基于症状的诊断替代基于个别病原体检测的诊断。
技术介绍
眼睛的感染在临床上可以按照载有感染物及随后被感染影响的解剖学分区分类。有许多的生物体能够引起眼睛感染，它们在“PrinciplesandPracticeofInfectiousDiseases，6thEdition，GeraldMandelletal(Eds)ElsevierChurchillLivingston，pp1387-1418(2005)”中有详细描述，其公开内容通过引用并入本文。眼感染可以基于临床初期诊断分为以下几类：1.外眼感染，如角膜炎和结膜炎2.感染性眼内炎3.葡萄膜炎4.视网膜炎许多外眼感染由几种细菌和真菌引起。事实上，由于暴露在环境中，结膜和角膜载有许多作为寄生者的非病原性细菌和真菌，这一事实不利于从结膜和角膜刮屑或拭子提取的特定病原体(细菌和真菌)的检测。在存在化脓或有脓液的溃疡的情况下，医生作出细菌感染的临时诊断(provisionaldignosis)并用局部使用的广谱抗生素治疗病人。但是，难于诊断却特别可治愈的重要感染有：●单纯性疱疹(引起角膜炎)●腺病毒性结膜-角膜炎(有时造成流行性扩散)●沙眼衣原体(引起导致沙眼的滤泡性结膜炎和成人包涵体性结膜炎)●水痘结膜炎(也称为带状疱疹结膜炎)●快速生长的分枝杆菌，如龟分支杆菌(M.chelonae)和偶发分枝杆菌(M.fortuitum)(引起用于减轻屈光异常的LASIK手术后的感染)感染性眼内炎可能通常由以下病原体引起：●革兰氏阳性细菌●革兰氏阴性细菌●厌气生物体，即痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)●真菌。非常常见的是感染在手术后发生且蔓延非常快，导致失明。治疗需要的最重要的信息是，病原体是细菌还是真菌，而如果是细菌，它是需氧的还是厌氧的。由血源性传播引起的内源性感染是很少见的。葡萄膜炎通常由以下病原体引起：●结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)●龟分支杆菌(M.chelonae)●偶发分枝杆菌(M.fortuitum)●鼠弓形体(Toxoplasmagondii)。视网膜炎一般在免疫抑制个体中见到，且由以下病原体引起：●巨细胞病毒●单纯疱疹病毒●水痘带状疱疹病毒严重的视力损失在所有这些病人中发生，因而早期和及时的对这些生物体的诊断对于防止整个眼球的失明很是重要的。这些感染的实际发生率在发展中国家可能相对较高。许多诊断技术是如在现有技术部分详细说明的用于眼睛感染的诊断。中枢神经系统感染可以分为以下几类：急性化脓性脑膜炎：一般在儿童中发现，且由以下所列的生物体引起：●流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)●脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)和●肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)脑脊液(CSF)的细菌培养或涂片镜检缺乏灵敏度。额外的复杂因素是，先前用抗生素对病人进行治疗可能导致CSF的革兰氏染色和培养两项的假阴性结果。由于这些原因，医生们不太愿意信任培养结果而倾向于完成一个静脉注射抗生素的10-14天完整疗程，这在大多数情况下是不必要的。一旦部分地进行了治疗，这些情况就不能与由下面的病原体引起的慢性脑膜炎区分开了：●结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)●各种真菌●由一系列可通过治疗控制的病毒-如HSV、CMV和VZV-引起的病毒性脑炎。脑炎通常由各种各样的病毒(地方性的和流行性的都有)引起。但是，单纯疱疹、巨细胞病毒和水痘带状疱疹是具有特定的抗病毒疗法的病毒。其它的可治疗脑炎病原体是鼠弓形体(Toxoplasmagondii)。现有技术检测临床样本中的病原体(细菌、酵母和其它真菌、寄生虫和病毒)的经典方法包括培养该样本以扩大所存在病原体的数目，直到可观察的菌落生长，然后该菌落生长可以通过标准的实验室检验鉴定和计数。在需要的时候，所述培养也可以进行附加的检验以确定病原体对药物治疗的敏感性。为了准确地鉴定感染种类，医生必须依赖于可能需要从3天(如在大多数细菌的情况下，包括快速生长的分枝杆菌)到8周(如在结核杆菌的情况下)之间的任何长度的时间的培养结果。为了准确地鉴别细菌的种类，该培养随后进行可能需要另外数天甚至数周时间的大范围生物化学检验。大多数情况下，由于疾病的严重程度和即时的药物干预的必要性，使这一确定过程快速完成是重要的。这里所指的培养技术在细菌感染和真菌感染的诊断中多半是有用的，而它们一般不用于病毒感染情况下的诊断，特别是因为通过培养从临床样本中分离病毒的频率小于15％。用于诊断感染(如眼睛感染和神经系统感染)的适当的样本是检测某症状(如角膜结膜炎、眼内炎、葡萄膜炎、脑膜炎和脑炎)的发病原因进行成功诊断的另一个关键问题。在这些情况下，感染是高度局部化的，而因此局限于眼睛或CNS。体液，如血液、血浆或血清，不包含感染物。外眼感染需要如角膜刮屑或结膜拭子的样本，而感染性眼内炎需要或者在眼科诊所进行玻璃体吸出或者更好是玻璃体切除的样本，在这样情况下，在手术室中取出20ml汉克平衡盐溶液的玻璃体洗液。简单的玻璃体吸出物经常不足以通过涂片检查和培养诊断真菌和细菌性眼内炎。在葡萄膜炎和视网膜炎两种情况下，较好的样本是收集在27号针中的0.2-0.3mL玻璃体液。用于诊断中枢神经系统感染的最好的生物液体是脑脊液。在本专利技术的一种实施方式中，在眼内炎的情况下房水或玻璃体液足以检测和鉴别感染物。这消除了在手术室中进行手术步骤(如玻璃体切除)的必要性。基于DNA的鉴别病原体的方法提供了对费时和需要具有专门训练和技术的人员的经典方法的简单、稳定和可靠的替代方案。在进行经典方法时，有可能会产生错误，这些错误有时导致对病原体的不明确的鉴定，而因此导致错误的诊断/治疗。另一方面，基于DNA的病原体鉴别具有在早得多的阶段鉴定病原体的优势，有时比观察到临床症状还早(亚临床阶段)。一旦条件被标准化，病原体的鉴别是十分简单可靠的，且能够由半熟练人员完成。基于DNA的方法也可以用于评价医疗干预的结果(预后价值)。采用基于DNA的方法(如PCR)筛查人的病原体的临床样本提供了灵敏和确定的诊断和有效治疗的开始，甚至对于每个样本包含非常少(大约20-50)病原生物体的小量的临床样本(房水、玻璃体液、泪水、唾液、血液、脑脊液、粘膜或上皮刮屑，如角膜刮屑、结膜拭子、组织样本等)也是如此。采用聚合酶链反应(PCR)技术的潜在利益是在相对短的时期内鉴定特定的细菌或病毒病原体。可行的基于PCR的检测具有在病人仍在急救室中本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别检测样本中引起病症的病原体的引物组组合，其中所述组合为：用于检测样本中已知引起葡萄膜炎的一种或多种病原体的第一引物组组合，其由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的组13、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的组14、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的组15及SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的组16组成；用于检测样本中已知引起感染性眼内炎的一种或多种病原体的第二引物组组合，其由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的组10、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的组11、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的组12、SEQ ID No.35和SEQ ID No.36的组18、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38的组19、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40的组20、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42的组21及SEQ ID No.43和SEQ ID No.44的组22组成；用于检测样本中已知引起脑膜脑炎的一种或多种病原体的第三引物组组合，其由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的组1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的组2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的组3、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的组4、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的组5、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的组6、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的组7、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16的组8、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的组13、SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的组16及SEQ ID No.35和SEQ ID No.36的组18组成；用于检测样本中革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的第四引物组组合，其由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的组10、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的组11、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的组12、SEQ ID No.35和SEQ ID No.36的组18、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40的组20、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42的组21及SEQ ID No.43和SEQ ID No.44的组22组成；和/或用于区分样本中已知引起急性和慢性脑膜炎的病原体的第五引物组组合，其由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的组10、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的组11、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的组12、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的组13、SEQ ID No.35和SEQ ID No.36的组18、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40的组20、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42的组21及SEQ ID No.43和SEQ ID No.44的组22组成。...

【技术特征摘要】
2007.06.01 IN 1178/DEL/20071.用于检测和鉴别样本中引起选自感染性眼内炎、角膜炎、葡萄膜炎、视网膜炎、脑膜炎和脑炎的病症的病原体的引物组组合，其中所述组合由以下引物组组成：组1为FP:5'cgcttggtttcggatgggag3'(SEQIDNo.1)RP:5'gcccccagagacttgttgtagg3'(SEQIDNo.2)组2为FP:5'ggcaatcgtgtacgtcgtccg3'(SEQIDNo.3)RP:5'cgggggggtcttgcgttac3'(SEQIDNo.4)组3为FP:5'caagctgacggacatttacaagg3'(SEQIDNo.5)RP:5'gtcccacacgcgaaacacg3'(SEQIDNo.6)组4为FP:5'ttccggctcatggcgttaacc3'(SEQIDNo.7)RP:5'cgccctgcttttacgttacgc3'(SEQIDNo.8)组5为FP:5'cggcgacgacgacgataaag3'(SEQIDNo.9)RP:5'caatctggtcgcgtaatcctctg3'(SEQIDNo.10)组6为FP:5'gggcacgtcctcgcagaag3'(SEQIDNo.11)RP:5'ccaagatgcaggtgataggtgac3'(SEQIDNo.12)组7为FP:5'ggtcttgccggagctggtattac3'(SEQIDNo.13)RP:5'tgcctccgtgaaagacaaagaca3'(SEQIDNo.14)组8为FP:5'tccatttaacgttgcatcattttgtg3'(SEQIDNo.15)RP:5'acgttccggtagcgagttatctg3'(SEQIDNo.16)组9为FP:5'cgccgccaacatgctctacc3'(SEQIDNo.17)RP:5'gttgcgggaggggatggata3'(SEQIDNo.18)组10为FP:5'tgggctacacacgtgctacaatgg3'(SEQIDNo.19)RP:5'cggactacgatcggttttgtgaga3'(SEQIDNo.20)组11为FP:5'ggcctaacacatgcaagtcgagc3'(SEQIDNo.21)RP:5'ggcagattcctaggcattactcacc3'(SEQIDNo.22)组12为FP:5'acgtcaaatcatcatgcccccttat3'(SEQIDNo.23)RP:5'tgcagccctttgtaccgtccat3'(SEQIDNo.24)组13为FP:5'gcggaacgtgggaccaatac3'(SEQIDNo.25)RP:5'cgacggggtgattttcttcttc3'(SEQIDNo.26)组14为FP:5'aacttttttgactgccagacacactattg3'(SEQIDNo.27)RP:5’ggatgccaccccccaaaag3'(SEQIDNo.28)组15为FP:5'tggttactcgcttggtgaatatgt3'(SEQIDNo.29)RP:5'gacgttttgccgactacctatcc3'(SEQIDNo.30)组16为FP:5'cccctctgctggcgaaaagtg3'(SEQIDNo.31)RP:5'ggcgaccaatctgcgaatacac3'(SEQIDNo.32)组17为FP:5’aatcgtatctcgggttaatgttgc3'(SEQIDNo.33)RP:5’tcgaggaaaaccgtatgagaaac3'(SEQIDNo.34)组18为FP:5'gctgggactgaggactgcgac3'(SEQIDNo.35)RP:5'ttcaagacgggcggcatataac3'(SEQIDNo.36)组19为FP:5'tggcgaacgggtgagtaaca3'(SEQIDNo.37)RP:5'ccggtattagccccagtttcc3'(SEQIDNo.38)组20为FP:5'cggcggcaagttcgacgac3'(SEQIDNo.39)RP:5'ccaccgagacgcccacacc3'(SEQIDNo.40)组21为FP:5'ccaggtcggcggagaagc3'(SEQIDNo.41)RP:5'ccaccggcccgatgacc3'(SEQIDNo.42)组22为FP:5'gccgccctgaccaccttc3'(SEQIDNo.43)RP:5'gcgggttgttcggcatcag3'(SEQIDNo.44)。2.如权利要求1所述的引物组组合，其中所述病原体选自单纯疱疹病毒1和2、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、真细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、鼠弓形体和沙眼衣原体。3.如权利要求1所述的引物组组合，其中所述病原体选自革兰氏阳性细菌。4.如权利要求1所述的引物组组合，其中所述病原体选自结核杆菌、龟分支杆菌和偶发分枝杆菌。5.如权利要求1所述的引物组组合，其中由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的组1、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的组2、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的组3、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8的组4、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10的组5、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12的组6、SEQIDNo.13和SEQIDNo.14的组7及SEQIDNo.15和SEQIDNo.16的组8组成的所述引物组组合检测样本中的病毒性视网膜炎；或其中由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的组1、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的组2、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的组3、SEQIDNo.17和SEQIDNo.18的组9及SEQIDNo.33和SEQIDNo.34的组17组成的所述引物组组合检测样本中的角膜结膜炎；或其中由SEQIDNo.25和SEQIDNo.26的组13、SEQIDNo.27和SEQIDNo.28的组14、SEQIDNo.29和SEQIDNo.30的组15及SEQIDNo.31和SEQIDNo.32的组16组成的引物组组合检测样本中的葡萄膜炎；或其中由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20的组10、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22的组11、SEQIDNo.23和SEQIDNo.24的组12、SEQIDNo.35和SEQIDNo.36的组18、SEQIDNo.37和SEQIDNo.38的组19、SEQIDNo.39和SEQIDNo.40的组20、SEQIDNo.41和SEQIDNo.42的组21及SEQIDNo.43和SEQIDNo.44的组22组成的引物组组合检测样本中的感染性眼内炎；或其中由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的组1、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的组2、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的组3、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8的组4、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10的组5、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12的组6、SEQIDNo.13和SEQIDNo.14的组7、SEQIDNo.15和SEQIDNo.16的组8、SEQIDNo.25和SEQIDNo.26的组13、SEQIDNo.31和SEQIDNo.32的组16及SEQIDNo.35和SEQIDNo.36的组18组成的引物组组合检测样本中的脑膜脑炎；或其中由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20的组10、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22的组11、SEQIDNo.23和SEQIDNo.24的组12、SEQIDNo.35和SEQIDNo.36的组18、SEQIDNo.39和SEQIDNo.40的组20、SEQIDNo.41和SEQIDNo.42的组21及SEQIDNo.43和SEQIDNo.44的组22组成的引物组组合检测样本中的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌；或其中由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20的组10、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22的组11、SEQIDNo.23和SEQIDNo.24的组12、SEQIDNo.25和SEQIDNo.26的组13、SEQIDNo.35和SEQIDNo.36的组18、SEQIDNo.39和SEQIDNo.40的组20、SEQIDNo.41和SEQIDNo.42的组21及SEQIDNo.43和SEQIDNo.44的组22组成的引物组组合区分样本中的急性和慢性脑膜炎的病原体，其中所述慢性脑膜炎由结核杆菌和各种真菌引起。6.如权利要求1所述的引物组组合，其中引物组1-22(SEQIDNo.1-44)检测样本中单纯疱疹病毒1和2、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、真细菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、结核杆菌、龟分支杆菌、偶发分枝杆菌、鼠弓形体和沙眼衣原体的靶核酸。7.如权利要求6所述的引物组组合，其中所述样本选自房水、玻璃体液、玻璃体切除洗液、角膜刮屑、结膜拭子和脑脊液。8.如权利要求1所述的引物组组合，其中所述引物采用生物素基团在5’端标记，导致通过形成有色产物进行检测；或者所述引物通过选自有机荧光标记和无机荧光标记的荧光标记进行标记，以使得能够通过任何设备或显微镜检方法检测。9.如权利要求8所述的引物组组合，其中所述有机荧光标记为异硫氰酸荧光素FITC，和所述无机荧光标记选自荧光纳米颗粒、QuantumDotsTM、Cy3和Cy5。10.用于检测和鉴别引起选自感染性眼内炎、角膜炎、葡萄膜炎、视网膜炎、脑膜炎和脑炎的特定病原体的病原体特异性探针DNA序列的组合，其中所述组合由以下探针DNA序列组成：“cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQIDNo.45)“ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQIDNo.46)“caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQIDNo.47)“ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQIDNo.48)“cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcg...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·拉奥，K·S·拉奥，P·V·拉姆钱德，H·N·玛德哈范，S·沙玛，G·萨特帕泰，V·B·拉维·库玛，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：印度;IN