核酸扩增装置、核酸扩增方法以及核酸扩增用芯片制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种往复流动型核酸扩增装置，包括：能够形成变性温度区和延伸/退火温度区的加热器；能够检测样品溶液在两个温度区之间的移动的荧光检测器；允许所述样品溶液在两个所述温度区之间移动的一对液体输送机构，并且当液体输送停止时，所述液体输送机构设置为对大气压开放；核酸扩增用芯片可以放置在其上的基板；以及通过接收来自所述荧光检测器的与所述样品溶液的移动有关的电信号来控制各液体输送机构的驱动的控制机构；该装置能够通过测量每次热循环的荧光强度而进行实时PCR。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种核酸扩增装置、核酸扩增方法以及核酸扩增用芯片。
技术介绍
核酸的检测是药物研发、法医学、临床试验、农产品和病原微生物类型鉴定等诸多领域的核心。通过分子系统发育分析而能够检测诸如癌症、微生物感染和基因标记等各种疾病是疾病和疾病发展风险的诊断、标记搜索、食品和环境安全评价、犯罪证据以及许多其它技术方面的通用技术。用于检测少量核酸(基因)的最强大的基础技术之一为一种用于对通过核酸序列的部分或全部进行呈指数地复制而获得的产物进行分析的方法。PCR是一种对DNA的特定区域进行选择性扩增的有效技术。利用PCR，可以从单一模板DNA分子快速地在模板DNA中复制产生数百万拷贝的目的DNA序列。在PCR中，重复进行两相或三相温度循环(称为“热循环”)从而依次进行以下各个反应：变成单链的DNA变性；形成变性的单链DNA的引物退火；以及使用耐热DNA聚合酶的引物延伸。重复该循环直至得到用于分析的足够拷贝数量。原理上，PCR的每次循环可使拷贝数量增加一倍。实际上，随着热循环的继续，所需反应物的浓度降低，使得扩增的DNA产物的构建最终停止。关于PCR大致细节，参见《PCR的临床应用》(DennisLo主编，于1998年由位于Totowa,NewJersey的Humana出版社出版)和《PCR协议-方法和应用指南》(M.A.Innis等主编，于1990年由位于SanDiego,California的学术出版社有限公司出版)。虽然PCR是一种对期望DNA进行选择性扩增的有效技术，而在完成PCR后有必要通过凝胶电泳等进行确认，用以对扩增的DNA进行确定。因此，作为一种改进的PCR方法，开发了一种根据期望DNA的扩增量的实时PCR进化或荧光淬灭技术，从而使样品中期望DNA的存在与否变得容易确认。在传统PCR方法中，当在PCR之前样品中模板DNA的量超出一定量时，PCR之后扩增的DNA的量通常进入平稳状态，而PCR之前的模板DNA的量无法进行定量。而在实时PCR方法中，在PCR进入平稳状态之前，可以对PCR过程中扩增的DNA的量进行实时检测；因此，可根据DNA的扩增状态来对PCR之前的模板DNA的量进行定量。因此，实时PCR方法也被称之为定量PCR方法。利用实时PCR的目的DNA量的定量具有特殊的临床效用，例如，用于监测病毒载量的变化，用以确认对诸如艾滋病病毒(HIV)等的病毒感染的治疗效果。利用实时PCR的DNA定量对机会性感染的诊断也是有效的，比如疱疹病毒(HHV)，许多患者自从婴儿期就已经亚临床感染并由于较弱的体质等原因而发展。PCR和实时PCR是通过热循环对基因进行呈指数地扩增的有效方法。用于PCR的通用热循环装置由于用作加热器的铝块的热容量较大，因而在温度控制方面较为缓慢，通常需要1到2小时、甚至在某些情况下需要更长时间才能进行PCR的30-40次循环。因此，即使使用现有最先进的基因测试装置，分析过程往往需要1小时以上。自从该技术开发以来，增加PCR的速度一直是一项巨大的挑战。业已开发了用于提高速度的各种方法。可将提高热循环样品的速度的方法分为以下三种类型。在第一种方法中，样品溶液被导入装置中，在一定时间内进行温度循环并且使溶液保持在同一部位(非专利文献(NPL)1和专利文献(PTL)1)。该方法意于通过减少样品的量而降低热容量，从而增加热循环的速度。然而，容纳腔或加热器本身的热容量的减少有一定限度。因此，每次循环至少需要约30秒才能实现足够的扩增反应。即使使用最快的装置，完成PCR反应也需要15分钟以上。第二种方法被称之为连续流动式PCR。在该方法中，样品溶液通过微通道流经彼此隔开的多个温度区，同时不停地进行溶液的连续进样。在这种连续流动式PCR方法中，已知的系统是通过使样品溶液流经三个控制为恒温的加热器上方的蛇形微通道而快速控制样品温度的(NPL2)。由于这种连续流动式PCR方法无需改变外部装置(如容器和加热器等)的温度，因此理论上可期望达到最快的温度控制。在极快的情况下，约7分钟之内完成DNA扩增。然而，采用连续流动式PCR进行定量实时PCR，有必要使得能够对各个蛇形微通道的全区或在同一温度区的每个蛇形微通道的30-50个区域进行荧光观察。具体地，需要可均匀地照射较大区域的激发光源和用于荧光观察的高灵敏度摄像机或行扫描器，因此必然导致系统结构体积较大且价格昂贵。在第三种方法中，如第二种方法，彼此间隔的多个温度区通过微通道而连接，并且使样品溶液往复地(reciprocally)流经相同微通道，且使得样品溶液在每个温度区停留一定时间段从而被加热(专利文献(PTL)2)。这种方法的优点在于进行热循环过程中样品与各温度区的接触时间可以自由设置。然而，为了导入样品并将其往复或旋转地泵至这些温度区，需要使用许多集成阀和泵以及用于观察样品溶液位置的检测器，用于防止样品溶液由于高温侧加热的样品中形成的小气泡的膨胀或由于在气液界面上形成的气压差(当样品溶液流经具有从用于变性反应95℃以上至用于退火反应约60℃的温度梯度的微通道时)而非意愿地流出微通道中的期望温度区位置，而且装置小型化困难(NPL3、NPL4和PTL3)。使用PCR/实时PCR装置的基因检测市场在有利增长。尤其是诸如病毒性肝炎、性传播疾病和流感等传染性疾病的基因检测，在日本也迅速展开。基因检测对于癌症治疗的作用已变得明显。例如，EGFR基因突变可用作施用癌剂Iressa的一个经验法则。因此，对于肺癌、胰腺癌等中的EGFR基因、K-ras基因，EWS-Flil基因、TLS-CHOP基因，SVT-SSX基因以及c-kit基因的基因检测最近已经进入保险的覆盖范围。在PCR中，引物被连接至模板DNA，并且位于引物序列之间的目的DNA专门由DNA聚合酶来检测。虽然PCR可用于检测DNA，但PCR不能直接检测RNA。因此，为了检测诸如流感病毒、诺如病毒(noroviruses)等RNA病毒，在以RNA为模板逆转录合成互补的cDNA后再进行PCR；也就是进行所谓的RT-PCR。因此，实质上必须进行一个两阶段的步骤。此外，PCR和RT-PCR需要快速升温和快速降温，因而需要特殊的孵化器。因此，问题在于：使PCR和RT-PCR的应用自动化并不容易。近年来，通过在一个PCR系统中使用多对引物而同时扩增多个基因区域的多重PCR引起人们的关注。从多重PCR发展而来的实时多重PCR，旨在受其他目的基因的影响(串扰)较小并且不损害灵敏度的条件下单独检测和定量多个不同的目的基因。然而，据报道，由于可标记的荧光物质波长重叠和种类问题使得两个以上的定量多重反应往往很难进行。目前，基因检测是在实验室或分析中心进行的。然而，如果有可现场快速进行基因测试的高速实时PCR装置，则可以现场确定治疗方案和对策。因此，这样的装置被认为是可以取代目前的基因测试装置的一个划时代的技术。特别是，作为防止口蹄疫、高致病性流感之类的流行病的检疫措施，用于对其进行现场快速准确的判断并防止继发性感染的传播是非常重要的。因此，需要大量这样的高速实时PCR装置。尤其是，为了实现在临床情景中或在发生传染病的现场立即进行基因测试的服务需求，需要一种低成本操作的、高速和高度便携式的实时PCR装置。引用列表专利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种往复流动型核酸扩增装置，包括：加热器，所述加热器能够形成变性温度区和延伸/退火温度区；荧光检测器，所述荧光检测器能够检测样品溶液在两个温度区之间的移动；一对液体输送机构，所述一对液体输送机构允许所述样品溶液在两个所述温度区之间移动，并且当液体输送停止时，所述液体输送机构设置为对大气压开放；基板，核酸扩增用芯片可以放置在所述基板上；以及控制机构，所述控制机构通过接收来自所述荧光检测器的与所述样品溶液的移动有关的电信号来控制各液体输送机构的驱动，所述装置能够通过测量每次热循环的荧光强度来进行实时PCR。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.08 JP 2014-1407581.一种往复流动型核酸扩增装置，包括：加热器，所述加热器能够形成变性温度区和延伸/退火温度区；荧光检测器，所述荧光检测器能够检测样品溶液在两个温度区之间的移动；一对液体输送机构，所述一对液体输送机构允许所述样品溶液在两个所述温度区之间移动，并且当液体输送停止时，所述液体输送机构设置为对大气压开放；基板，核酸扩增用芯片可以放置在所述基板上；以及控制机构，所述控制机构通过接收来自所述荧光检测器的与所述样品溶液的移动有关的电信号来控制各液体输送机构的驱动，所述装置能够通过测量每次热循环的荧光强度来进行实时PCR。2.一种核酸扩增用芯片，包括至少一个微通道，所述微通道包括：弯曲微通道，所述弯曲微通道分别用于根据权利要求1所述的核酸扩增装置的所述变性温度区和所述延伸/退火温度区；直线中间微通道，所述直线中间微通道连接所述弯曲微通道；以及连接部，所述连接部位于所述微通道的两端，所述连接部可连接至根据权利要求1所述的核酸扩增装置的所述液体输送机构。3.根据权利要求1所述的核酸扩增装置，其中，所述液体输送机构为微型鼓风机或风扇。4.一种核酸扩增方法，包括以下步骤：步骤1：将根据权利要求2所述的核酸扩增用芯片放置在根据权利要求1所述的基板上，使得所述变性温度区和所述延伸/退火温度区分别包括弯曲微通道；步骤2：将样品溶液导入所述微通道中；步骤3：将一对液体输送机构连接至位于所述微通道两端的液体输送机构连接部；以及步骤4：利用所述液体输送机构将所述样品溶液在所述微通道...

【专利技术属性】
技术研发人员：永井秀典，古谷俊介，萩原义久，渊胁雄介，
申请(专利权)人：国立研究开发法人产业技术综合研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP