一种可控制液体环流路径的核酸扩增反应管制造技术

本发明专利技术涉及一种核酸扩增反应管，特别是涉及一种可控制液体环流路径的核酸扩增反应管。此外，本发明专利技术还涉及一种扩增核酸的方法，其包括使用本发明专利技术的可控制液体环流路径的反应管。此外，本发明专利技术还涉及一种包含所述反应管的核酸扩增反应装置。此外，本发明专利技术还涉及包含所述反应管的试剂盒，以及所述反应管用于制备试剂盒的用途。本发明专利技术的反应管能够提高聚合酶链式反应的效率及不同反应管在任意时间点的有效扩增效率的一致性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，特别是核酸扩增领域。具体而言，本专利技术涉及一种核酸扩增反应管，特别是一种可控制液体环流路径的核酸扩增反应管。此外，本专利技术还涉及一种扩增核酸的方法，其包括使用本专利技术的可控制液体环流路径的核酸扩增反应管。此外，本专利技术还涉及一种包含所述反应管的核酸扩增反应装置。此外，本专利技术还涉及包含所述反应管的试剂盒，以及所述反应管用于制备试剂盒的用途。
技术介绍
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，是一种体外快速扩增DNA的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程。首先，在大约95℃的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应；然后，温度迅速降到大约50-65℃的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应；退火反应结束后，温度要迅速升高到72℃左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，数量增加了一倍。每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近109倍。PCR是体外大量获得目的DNA片段的方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将
热量通过反应管传递至PCR反应液。这种装置的缺陷是：反应体积较大，即系统通常具有较大的体积和热容，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热通过反应管传递至PCR反应液，因此，PCR难以实现快速高效。2002年Madhavi Krishnan等人报导的雷诺本纳德(Rayleigh-Benard)PCR(简称RB-PCR)方法，基于热传导及热对流原理，利用上下两个恒温热源建立具自下而上温度梯度的封闭反应内腔，并因此使腔内的PCR试剂发生自发的对流运动反复流经不同温度区域从而完成扩增。该方法扩增速度快、仪器较传统PCR仪简单，但扩增试剂须充满整个封闭腔，造成上样难度大、易泄漏、易污染等问题。台湾大学Chou等在RB-PCR技术的基础上做了改进，将封闭的反应内腔变成开放式的具特定规格的反应试管，并利用单一恒温热源加热试管底部驱动管内试剂自发循环，从而完成扩增。该方法解决了RB-PCR易泄漏、污染的问题。但现有的对流PCR扩增方法均存在共同的缺陷，即管内液体流动路径复杂。管内流路为近同心椭圆型的多层流路(图1a)，这种多层次的复杂流路在扩增中存在以下问题：1.扩增效率偏低：(a)变性的效率：如图1a所示，从不低于模板或扩增子所需的变性温度的D1区经过的模板或扩增子，可发生有效的变性；而从位置高于D1区的D2区经过的模板或扩增子，则无法发生有效的变性反应，导致总体变性效率偏低；(b)退火的效率：如图1a所示，从不高于模板或扩增子所需的退火温度的A1区经过的单链模板及引物，才有可能发生有效的退火反应；而从位置低于A1区的A2区经过的单链模板及引物，则无法发生有效的退火反应，导致总体退火效率偏低。2.扩增的特异性不好：在对流PCR中，因没有固定温度的退火区域及时段，因此通常会
通过温度场及流场的控制进而使得反应管上端的温度低于引物的退火温度，用以保障引物能够尽可能充分的退火。但当单链模板和(/或)引物在环流中经过过低的温度区域时，会导致退火的特异性降低，容易形成引物内部或引物间或引物与模板(/扩增子)之间的非特异性的配对，并进而发生延伸反应，形成非特异性扩增产物。3.平行反应在扩增中可能存在管间差异：(a)终点定性检测，在结果上主要表现为扩增效率及产物组成的差异：上述第2点中描述的非特异性扩增产物经变性后，又会变成下一轮非特异性扩增的模板，从而使得非特异性扩增不断放大，并与正确的扩增竞争引物、酶、dNTP等反应组分，使得正确扩增受到抑制，反应效率降低。而这种非特异性反应是否发生、发生的早晚、发生的比例都是不受控制的，即存在一定的随机性，这就会导致发生了此类非特异性扩增的反应管的扩增效率的不一致。非特异性扩增发生的较早、发生比例较高的反应管，其效率低于非特异性扩增发生的较晚、发生比例较低的反应管，并均低于未发生非特异性扩增的反应管。同样的，非特异性扩增发生的较早、发生比例较高的反应管，其管内产物组成中有较高比例的非特异性产物，非特异性扩增发生的较晚、发生比例较低的反应管，其管内产物组成中有较低比例的非特异性产物，未发生非特异性扩增的，其管内产物均为正确扩增产物。(b)实时定量检测，在结果上主要表现为单位时间内有效扩增效率的差异：也就是说，无法进行实时定量检测。同上述1、2两点的描述，当对流PCR反应起始，双链模板能否经过有效地变性区域、单链模板和引物能否经过有效地退火区域、以及退火中是否发生了非特异性的反应，都是不受控制的，因此在反应起始就有可能造成不同管的产物组成存在差异，这些差异不仅会导致上述3(a)中描述的问题，还使得单位时间内，不同反应管的产物(模板)数量存在差异，进入指数扩增期的时间点就会不同，因此无法用传统的实时监测方法进行模板的定量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的核酸扩增反应管以及核酸扩增方法，以解决现有的对流PCR技术中存在的扩增效率偏低、特异性不好、管间差异大、定量不准确等问题。本专利技术的第一方面提供一种核酸扩增反应管，包括一端封闭的管体，所述管体包括储液区以及位于储液区下方的核酸扩增区，其特征在于，所述核酸扩增区内设置有上下悬空的插片。当反应管内注入试剂时，通过插片的物理阻隔，使得反应管内试剂在外力或内力的作用下，形成围绕插片上方及下方的环流路径。优选地，所述插片沿管体的中轴线设置，并且插片的两侧与核酸扩增区的内壁连接。插片沿管体的中轴线方向将核酸扩增区分隔成第一区域和第二区域，第一区域和第二区域在核酸扩增区的上部和下部连通。优选地，所述插片下端与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区高度的1/2；更优选地，所述插片下端与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区高度的1/3；进一步优选地，所述插片下端与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于4mm。优选地，所述插片上端与核酸扩增区上端之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区高度的1/2；更优选地，所述插片上端与核酸扩增区上端之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区高度的1/3；进一步优选地，所述插片上端与核酸扩增区上端之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于3mm。优选地，所述管体的底部通过与管体相互配合的底塞实现一端封闭。优选地，所述管体与底塞之间通过旋转螺纹结构，或环状卡口结构，或凸点锁扣结构相互密闭连接，也可以采用现有技术中其它的密闭连接方式。优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增反应管，包括一端封闭的管体(1)，所述管体(1)包括储液区(4)以及位于储液区下方的核酸扩增区(3)，其特征在于，所述核酸扩增区(3)内设置有上下悬空的插片(2)。

【技术特征摘要】
2015.05.12 CN 20151023701881.一种核酸扩增反应管，包括一端封闭的管体(1)，所述管体(1)包括储液区(4)以及位于储液区下方的核酸扩增区(3)，其特征在于，所述核酸扩增区(3)内设置有上下悬空的插片(2)。2.权利要求1的反应管，其特征在于，当反应管内注入试剂时，通过插片(2)的物理阻隔，使得反应管内试剂在外力或内力的作用下，形成围绕插片上方及下方的环流路径。3.权利要求1的反应管，其特征在于，所述插片(2)沿管体(1)的中轴线设置，并且插片的两侧(a，b)与核酸扩增区(3)的内壁连接，优选地，插片插片(2)沿管体(1)的中轴线方向将核酸扩增区分隔成第一区域(3-1)和第二区域(3-2)，第一区域(3-1)和第二区域(3-2)在核酸扩增区的上部(3-A)和下部(3-B)连通。4.权利要求1至3任一项的反应管，其特征在于，所述插片(2)下端(d)与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区高度的1/2；优选地，所述插片(2)下端(d)与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区(3)高度的1/3；进一步优选地，所述插片(2)下端(d)与管体底部之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于4mm。5.权利要求1至3任一项的反应管，其特征在于，所述插片(2)上端(c)与核酸扩增区(3)上端之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区(3)高度的1/2；优选地，所述插片(2)上端(c)与核酸扩增区(3)上端之间的
\t距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸扩增区(3)高度的1/3；进一步优选地，所述插片(2)上端(c)与核酸扩增区(3)上端之间的距离大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于3mm。6.权利要求1至3任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛胜祥，张师音，徐飞海，王进，李金洁，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35