核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供一种能够有效进行核酸扩增的新的核酸扩增反应方法。该核酸扩增方法包含如下工序：将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液相比比重小且不与核酸扩增反应液混和的液体；将该核酸扩增反应容器的第2区域加热到比第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于上述第2区域的下方，上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；以及，将第2配置切换到第1配置的工序；并且，核酸扩增反应液含有探针，该探针含有人工核酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸扩增方法。
技术介绍
近年来，因基因利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到瞩目，除此之外，在农业、畜牧业领域也已开发出多种将基因用于鉴别品种、改良品种的方法。作为用于利用基因的技术，PCR(聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction)法等核酸扩增技术正在广泛普及。近年来，开发了能够在短时间内得到核酸扩增反应产物的PCR装置(例如，专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2012-115208
技术实现思路
本专利技术的专利技术人等在使用了日本特开2012-115208中记载的PCR装置的核酸扩增反应中，发现如果缩短热变性和退火/延伸时间，则有时核酸扩增效率下降。于是，为了寻找其原因并解决问题，进行了深入研究，结果发现通过在该PCR装置中使用人工核酸，能够有效地进行核酸扩增。因此本专利技术的目的在于提供一种能够高效地核酸扩增的新的核酸扩增方法。本专利技术的一个实施方式是一种核酸扩增方法，包含如下工序：将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液相比比重小且不与核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器的第2区域加热到比上述第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方，第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；以及，将第2配置切换到第1配置的工序；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。探针与仅含有天然核酸的探针相比，可以与模板核酸的结合力更大。人工核酸可以为LNA、3’-氨基-2’,4’-BNA、2’,4’-BNACOC、2’,4’-BNANC、PNA、GNA或TNA。人工核酸可以是LNA。探针可以是被标记过的探针。标记过的探针可以是进行了RI标记、荧光标记或酶标记。本专利技术的另一实施方式是一种核酸扩增反应装置，该核酸扩增反应装置包含如下结构：安装部，可安装填充有核酸扩增反应液和与所述核酸扩增反应液相比比重小且不与所述核酸扩增反应液混和的液体的核酸扩增反应容器；第1加热部，将所述核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度；第2加热部，将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度；以及，驱动机构，对第1配置和第2配置进行切换，所述第1配置为所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方，所述第2配置为所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。根据本专利技术，可提供一种能够有效地进行核酸扩增的新的核酸扩增方法。附图说明图1是本专利技术的一个实施方式中使用的核酸扩增反应容器的截面图。g表示重力方向。图2是本专利技术的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的立体图。(A)表示关闭盖的状态，(B)表示打开盖的状态。图3是本专利技术的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的主体的分解立体图。图4是示意地表示本专利技术的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的主体的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。(A)表示第1配置，(B)表示第2配置。图5是表示本专利技术的一个实施方式和比较例中的表示核酸扩增反应产物量的荧光亮度测定值与热循环数的关系的图。具体实施方式本专利技术的目的、特征、优点及其构思根据本说明书的记载对本领域技术人员而言是明确的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员，就能容易地再现本专利技术。以下记载的专利技术的实施方式和具体的实施例等表示本专利技术优选的实施方式，是用于例示或说明而示出的，本专利技术不限于这些。在本说明书中公开的本专利技术的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改变和修饰，这对本领域技术人员而言是明确的。(1)核酸扩增方法本专利技术的核酸扩增方法的特征在于，包含如下工序：将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液相比比重小且不与上述核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器的第2区域加热到比第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于上述第2区域的下方，上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；以及，将第2配置切换到上述第1配置的工序；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。核酸扩增反应液可含有核酸扩增反应用试剂和扩增对象的靶核酸。作为靶核酸，例如，可举出由血液、尿、唾液、脑脊髓液、组织等被检测物制备得到的DNA，或将由这些被检测物制备得到的RNA进行逆转录的cDNA等。核酸扩增反应用试剂可含有用于扩增靶核酸的引物对、缓冲液、聚合酶、dNTP、MgCl2和用于对靶核酸的扩增产物进行检测的荧光标记等。DNA聚合酶没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如，Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它们的改良型等大量市售品，优选进行热启动的DNA聚合酶。dNTP、盐的浓度只要为对于使用的酶而言适当的浓度即可，通常可以为如下浓度：使dNTP为10～1000μM，优选100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选200～700mM，对总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于120mM的浓度，进一步优选高于150mM的浓度，进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。本专利技术中，核酸扩增反应液含有包含人工核酸的探针。本说明书中，人工核酸是指可通过氢键能够与DNA、RNA的碱基键合的天然核酸分子以外的核酸分子。本专利技术中使用的人工核酸的种类没有特别限定，但特别优选与仅由天然核酸构成的探针相比，使探针与互补链的Tm值变高、与模板核酸的结合力提高的人工核酸，优选使核酸的核糖环的2’位的氧原子与4’位的碳原子进行亚甲基交联的2’,4’-BNA(2′-O,4′-C-甲醇交联核酸，2′-O,4′-C-methano-bridgednucleicacid，别名LNA(锁核酸，LockedNucleicAcid))。以下示出LN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增方法，包含如下工序：将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，所述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与所述核酸扩增反应液相比比重小且不与所述核酸扩增反应液混和的液体；将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到比所述第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其中，所述第1配置为所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方，所述第2配置为所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方；和将所述第2配置切换到所述第1配置的工序；并且，所述核酸扩增反应液含有探针，该探针含有人工核酸。

【技术特征摘要】
2014.11.20 JP 2014-2353301.一种核酸扩增方法，包含如下工序：
将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，所
述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与所述核酸扩增反应液
相比比重小且不与所述核酸扩增反应液混和的液体；
将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到比所述第1温度低的第
2温度的工序；
将第1配置切换到第2配置的工序，其中，所述第1配置为所述第
1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方，所述第2配置为所
述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方；和
将所述第2配置切换到所述第1配置的工序；
并且，所述核酸扩增反应液含有探针，该探针含有人工核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，所述探针，与仅
含有天然核酸的探针相比，对模板核酸的结合力大。
3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，所述人工核酸为
LNA、3’-氨基-2’,4’-BNA、2’,4’-BNACOC、2...

【专利技术属性】
技术研发人员：上原雅行，
申请(专利权)人：精工爱普生株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP