一种检疫技术领域的食源性致病菌ＰＣＲ检测中的多重扩增内标序列及其制备方法；所述食源性致病菌ＰＣＲ检测中的多重扩增内标序列的碱基序列如下：１０５４Ｆ－１５ｂｐ－ｈｌｙＡＦ－１５ｂｐ－ＰｒｓＦ－１５ｂｐ－ＰＳＦ－１５ｂｐ－ＳＡ１Ｆ－扩增内标序列－ＳＡ１Ｒ－１５ｂｐ－ｈｌｙＡＲ－１５ｂｐ－ＰＳＲ－１５ｂｐ－ＰｒｓＲ－１５ｂｐ－１０５４Ｒ；所述多重扩增内标序列的制备方法包括如下步骤：随机重排ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的核酸作为扩增内标序列；随机重排碱基序列ＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣ，选择任一序列作为长度为１５ｂｐ的序列；采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为１５ｂｐ的序列以及碱基序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：８～１７所示的１０条序列构建得到多重扩增内标。使用本发明专利技术的多重扩增内标可使ＰＣＲ检测结果能指示假阴性的发生，提高ＰＣＲ检测的准确率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
的多重扩增内标序列及其制备方法，具体是一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法。
技术介绍
mIAC(multiple internal amplification control)是指多重扩增内标，艮卩添力口到PCR反应体系中，用以指示假阴性现象的一段DNA序列或者是一段致病菌的看家基因序列。中国加入WTO后，食品安全问题越来越成为制约我国对外贸易的主要障碍，严重地阻碍着我国的经济发展、影响人民的身体健康，因此通过发展快速的检测技术来解决食品安全问题是国家所需求的。但是目前我国对食品中5种重要致病菌抓副溶血弧菌、大肠杆菌0157:H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的国标检验方法仍是采用传统的培养方法，由于此方法费时费力，而且灵敏度又不高，已不能满足食品加工与生产中对致病菌快速检测的需求。 所以建立准确、快速的食源性致病菌PCR检测方法能促进我国及时、有效地进行食源性疾病的预防、预警和控制，保障人民的身体健康。虽然随着PCR技术的不断发展、改进，此技术已在许多方面都有了很大程度的提高，但在近来的一些应用实践中显示，PCR反应结果常常会呈现假阴性现象，究其原因，PCR反应会因抑制剂等的影响而抑制反应的发生，造成假阴性现象的发生，因此，在PCR检测中出现假阴性的现象就成为研究者所最为关心的问题之一，而这一问题也一直没有得到很好的解决。 经对现有技术的文献检索发现，刘斌等人于2006年根据沙门氏菌stn基因的一段特异DNA序列运用复合引物技术构建了扩增内标，并用于沙门氏菌的普通PCR检测(刘斌，史贤明；扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用.微生物学通报，2006，33 :156 161)。但由于刘斌等人用于构建内标的序列是源于沙门氏菌本身，这样难免会出现错配、同源性交联干扰等现象； Younes Maaroufi等于2006年建立了一种多重扩增内标合成方法，该方法运用复合引物技术将EBV、 CMV、 TGO、 hoPoV和HBV的特异检测引物序列依次添加到一段扩增内标序列上，构建了同时含这五种病毒检测引物序列的多重扩增内标(Younes Maaroufi，Jean—Marc deBruyne， Valerie Duchateau， Robert Scheen and Francoise Crokaert.Development ofa multiple internal control for clinical diagnostic real—timeamplificationassays. FEMS Immunology and Medical Microbiology,2006，48 :183 191.) (Yo皿esMaaroufi， Jean-Marc de Bruyne， Valerie Duchateau， Robert Scheen andFrancoiseCrokaert.用于临床诊断实时扩增实验的多重扩增内标的研制.FEMS免疫学与医学微生物学.2006,48 :183 191.)。而Younes Maaroufi等构建的多重扩增内标是用于临床研究方面的，而在食品安全检测方面，添加有多重扩增内标的检测方法却还很少有人加以研究应用； 2007年，Jessica L. Nordstrom等人在用多重荧光定量PCR检测牡蛎中的全部及致病性的副溶血弧菌时，将一条人工构建的扩增内标添入检测体系中，用以指示假 阴 性 (JessicaL Nordstrom, Michael C丄Vickery， George M. Blackstone， Shelley L. Murray, and Angelo DePaola. Development of a Multiplex Real—Time PCR Assay with aninternal Amplfication Control for the Detection of Total and Pathogenic Vibrioparahaemolyticus Bacteria in Oysters. Applied and Environmental Microbiology,2007，73 (18) :5840 5847) (Jessica L. Nordstrom, Michael C丄Vickery，GeorgeM. Blackstone, Shelley L Murray, and Angelo DePaola.用于检测牡 蛎中所有及致病性副溶血弧菌的添加有扩增内标的多重荧光定量PCR实验的建立.应用与 环境生物学.2007,73(18) :5840 5847)。 Jessica L. Nordstrom等人用一条外源DNA作 为扩增内标，他们所构建的扩增内标是非竞争性的扩增内标，也即所用的检测引物不能同 时扩增目的片段和扩增内标，整个PCR体系中至少有两对引物， 一对用于扩增目的片段，一 对用于扩增扩增内标，这样很容易引起引物间的相互干扰作用，同时也很难达到PCR的最 佳反应条件； 2008年，龙飞等人在检测单核细胞增生李斯特菌时将扩增内标进行了进一步 地改进，构建了活菌内标，使得所构建的扩增内标不仅仅在PCR扩增反应中能起到指 示假阴性的作用，而且在增菌培养、菌体收集、DNA提取等所有过程都能指示假阴性的 出现(Fei Long, Xin_na Zhu， Zhong-ming Zhang， Xian-ming Shi. Development of a qimntitativ印olymerase chain reaction method using a live bacterium as internal control forthe detection of Listeria monocytogenes. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease，2008，62 :374 381) (龙飞，朱欣娜，张忠明，史贤明.以活菌作为 扩增内标的用于检测单核细胞增生李斯特菌的PCR反应体系的建立.诊断微生物学与传染 病.2008,62 :374 381)，尽管龙飞等人构建的扩增内标可以达到全程指示假阴性，但是他 们所构建的扩增内标是单一的，不能应用于多种食源性致病菌的PCR检测中去。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种食源性致病菌PCR检测中的 多重扩增内标序列及其制备方法。使用本专利技术的多重扩增内标可使PCR检测结果能够指示 假阴性的发生，避免了因样品中存在抑制剂或操作失误而导致检测结果呈现假阴性以至于 做出错误的结果判断，从而提高了 PCR检测的准确率，可满足检疫执法的需要。 本专利技术通过以下技术方案实现， 本专利技术涉及一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列，该序列的碱基序 列如下 1054F—15bp—hlyAF—15bp—PrsF—15bp—PSF--15bp--SAlF--扩增内标序列--SAlR—15bp—hlyAR—15bp—PSR—-15bp—PrsR—15bp—1054R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食源性致病菌ＰＣＲ检测中的多重扩增内标序列，其特征在于，该序列的碱基序列如下： １０５４Ｆ－－１５ｂｐ－－ｈｌｙＡＦ－－１５ｂｐ－－ＰｒｓＦ－－１５ｂｐ－－ＰＳＦ－－１５ｂｐ－－ＳＡ１Ｆ－－扩增内标序列－－ＳＡ１Ｒ－－１５ｂｐ－－ｈｌｙＡＲ－－１５ｂｐ－－ＰＳＲ－－－１５ｂｐ－－ＰｒｓＲ－－１５ｂｐ－－１０５４Ｒ； 其中， 所述１０５４Ｆ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８所示； 所述１０５４Ｒ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９所示； 所述ｈｌｙＡＦ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０所示； 所述ｈｌｙＡＲ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１所示； 所述ＰｒｓＦ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２所示； 所述ＰｒｓＲ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３所示； 所述ＰＳＦ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４所示； 所述ＰＳＲ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５所示； 所述ＳＡ１Ｆ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６所示； 所述ＳＡ１Ｒ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７所示； 所述１５ｂｐ为由如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８所示的的碱基序列随机重排后得到的任一序列； 所述扩增内标序列具体为：随机重排ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的任一核酸作为扩增内标序列； 所述五种目的基因具体为碱基序列分别如ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３～７所示的基因。...
【技术特征摘要】
一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列，其特征在于，该序列的碱基序列如下1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R；其中，所述1054F的碱基序列如SEQ ID NO8所示；所述1054R的碱基序列如SEQ ID NO9所示；所述hlyAF的碱基序列如SEQ ID NO10所示；所述hlyAR的碱基序列如SEQ ID NO11所示；所述PrsF的碱基序列如SEQ ID NO12所示；所述PrsR的碱基序列如SEQ ID NO13所示；所述PSF的碱基序列如SEQ ID NO14所示；所述PSR的碱基序列如SEQ ID NO15所示；所述SA1F的碱基序列如SEQ ID NO16所示；所述SA1R的碱基序列如SEQ ID NO17所示；所述15bp为由如SEQ ID NO18所示的的碱基序列随机重排后得到的任一序列；所述扩增内标序列具体为随机重排SEQ ID NO1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的...
【专利技术属性】
技术研发人员：史贤明，何晓华，刘斌，施春雷，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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