大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。本发明专利技术以食源性致病菌大肠杆菌O157：H7为靶标进行筛选，获得针对大肠杆菌O157：H7全细胞亲和性较强的几段多肽，丢弃筛选所用离心管的负筛选步骤减少了离心管材料聚苯乙烯PS对筛选结果的影响；所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对大肠杆菌O157：H7具备强于原始肽库的亲和力；筛选得到的四段多肽具备在大肠杆菌O157：H7细胞表面富集的特征，利用大肠杆菌O157：H7亲和十二肽制备获得的新型溶菌酶具备靶向亲和到大肠杆菌上的效果，具有较高酶活。

Escherichia coli O157:H7 affinity twelve peptide and screening method and application thereof

The present invention discloses Escherichia coli O157:H7 twelve affinity peptide and screening method and application thereof, the amino acid sequence of SEQ ID NO.1 ~ SEQ ID NO.4 shown any. The food borne pathogenic bacteria Escherichia coli O157:H7 as a target for screening, obtained for Escherichia coli O157:H7 whole cell strong affinity for several peptides, discarded screening using negative selection steps of the centrifuge tube to reduce the influence of centrifugal tube material polystyrene PS on screening results; the screened peptide contains affinity monoclonal phages of E. coli O157:H7 has strong affinity to the original peptide library; screening four peptides in Escherichia coli O157:H7 cells have the characteristics of surface enrichment, model of lysozyme using Escherichia coli O157:H7 twelve affinity peptide preparation obtained with targeted affinity into Escherichia coli on the effect of high enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，更具体地讲，涉及大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用。
技术介绍
食源性疾病的发病率在过去的几年里有所增加，并成为全球主要的公共卫生问题。食源性致病菌是导致食源性疾病的一个重要的诱因，因此，对食源性致病菌进行分析检测、并控制其蔓延具有重要意义。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病菌，危害广泛，容易出现在蔬菜水果等食品中。而这类即食食品的清洗消毒和其中大肠杆菌O157：H7的检测还没有实现快速、安全、环保和有效。利用噬菌体展示技术对多肽进行筛选，是分子生物学领域的重要研究技术。对噬菌体展示肽库进行淘选可以得到针对材料或者生物分子以及有机小分子的亲和肽。目前已有许多针对材料、小分子以及生物分子和全细胞进行的筛选。而针对病原微生物大肠杆菌O157：H7的亲和多肽还没有报道。抗菌酶作为新型生物抗菌剂，具有高效、无毒、无残留等优点，在食品工业、医疗消毒以及洗涤剂等的应用中必将具有广阔的前景。它在实际应用中面临一些问题与挑战，主要表现在：酶的价格较高；抗菌酶作用效率还不够高，因此使用量也要提高；实际应用抗菌酶时，其稳定性及环境因素也需考虑。如何提高酶活并保持酶的稳定性，提高酶对目标微生物的靶向性和利用效率是需要重点关注的。溶菌酶通过水解某些细菌种类的细胞壁肽聚糖层杀死细菌，因此其可被推荐为天然抗菌剂。然而，溶酶菌只对革兰氏阳性细菌起作用，所以促使科学家通过几种类型的化学修改来提高溶菌酶的抗菌效果。在针对改性溶菌酶在食品中对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌增长的控制效果的研究中，修饰不仅增强了溶菌酶的功能属性(如溶解度和热稳定性)，而且扩展了溶菌酶的活性范围。总的来说改性溶菌酶是应用在食品工业中极好的天然食品清洗剂。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽。本专利技术的第二个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的筛选方法。本专利技术的第三个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的应用。本专利技术第四个目的在于提供一种新型溶菌酶。本专利技术第五个目的在于提供新型溶菌酶的应用。为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.4任一所示。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以大肠杆菌O157：H7细菌全细胞作为靶分子，将其与噬菌体展示十二肽库混合，通过离心分离对肽库进行筛选，并通过丢弃筛选所用离心管的方法去除聚苯乙烯PS材料对筛选带来的影响，最后对筛选得到的噬菌体克隆进行DNA测序和分析，并采用ELISA比较亲和性。为实现本专利技术第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌的抗菌材料中的应用。大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌的检测试剂或检测芯片中的应用。大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备新型溶菌酶中的应用，其特征在于，将SEQIDNO.1～SEQIDNO.4任一所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达，得到对大肠杆菌具备亲和性的新型溶菌酶。大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备食品清洗消毒剂中的应用。为实现本专利技术第四个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种新型溶菌酶，其特征在于，将SEQIDNO.1所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达获得，其氨基酸序列为SEQIDNO.5所示。为实现本专利技术第五个目的，本专利技术公开以下技术方案：新型溶菌酶在制备食品清洗消毒剂中的应用。本专利技术筛选的4条十二肽的氨基酸序列分别为：SEQIDNO.1：SGVYKVAYDWQH(P1)；SEQIDNO.2：GLHTSATNLYLH(P2)；SEQIDNO.3：VVSPDMNLLLTN(P3)；SEQIDNO.4：VFSSMVHVLNTH(P4)。本专利技术获得的新型溶菌酶氨基酸序列为SEQIDNO.5：MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVGGGGSSGVYKVAYDWQH。本专利技术的优点在于：本专利技术是以食源性致病菌大肠杆菌O157：H7为靶标进行筛选，获得针对大肠杆菌O157：H7全细胞亲和性较强的几段多肽，丢弃筛选所用离心管的负筛选步骤减少了离心管材料聚苯乙烯PS对筛选结果的影响；所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对大肠杆菌O157：H7具备强于原始肽库的亲和力；筛选得到的四段多肽具备在大肠杆菌O157：H7细胞表面富集的特征。为开发以亲和多肽为基础的抗菌材料、食品清洗消毒剂、检测试剂或检测芯片等提供了物质基础和有效途径。利用大肠杆菌O157：H7亲和十二肽制备获得的新型溶菌酶具备靶向亲和到大肠杆菌上的效果，具有较高酶活。该溶菌酶具备强于单独溶菌酶的酶活，在抑制界面上病原菌的生长效果方面表现突出，明显好于单独的溶菌酶，在清洗蔬菜水果方面具有一定的效果，可作为食品清洗剂来使用。这为开发新一代抗菌剂和食品清洗消毒剂提供有效途径。附图说明图1.筛选得到的所有十二肽中氨基酸残基出现的频率。图2.四段多肽的二级结构模拟图。图3.ELISA测定多肽P1对大肠杆菌O157：H7的亲和性。图4.四段多肽对三种菌的亲和度柱状图。图5.四段多肽在大肠杆菌O157：H7菌膜上的吸附柱状图。图6.基因测序结果。图7.表达蛋白的SDS-PAGE电泳，1-5：人溶菌酶诱导前、诱导后、培养液、破碎上清、破碎沉淀、6：Marker、7-11:新型溶菌酶诱导前、诱导后、培养液、破碎上清、破碎沉淀。图8.表达蛋白的酶活测定。图9.葡萄糖氧化酶、溶菌酶、过氧化氢酶、融合蛋白的抑菌效果。图10.溶菌酶和包含亲和肽的溶菌酶清除蔬菜水果表面微生物效果比较。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.肠杆菌O157：H7亲和十二肽筛选淘选过程简述(reference：J.Phys.:Condens.Matter19(2007)395011(13pp))：1.选用OD6600.5的O157:H7细胞，加入10μL噬菌体肽库(1011)，悬浮于1mLPBS溶液,室温下温育60min；2.在16,000×g下离心5min,将细菌和噬菌体沉淀下来；3.去除未吸附的噬菌体，用1mL的TBS/Tween缓冲液洗10次，16,000×g，5min，最后一遍更换新的离心管；4.亲和的噬菌体与细胞最后被200μL的0.2Mglycine-HCl(pH2.2)洗脱,室温下轻微震荡10min,离心取上清；5.最后用150μL的1MTris-HCl(pH9.1)中和。6.测定噬菌体滴度：①细菌的准备：接种ER2738单克隆至5mLLB培养基中，37℃振荡培养至对数生长中本文档来自技高网...

【技术保护点】
大肠杆菌O157：H7亲和十二肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌O157：H7亲和十二肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.4任一所示。2.权利要求1所述大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以大肠杆菌O157：H7细菌全细胞作为靶分子，将其与噬菌体展示十二肽库混合，通过离心分离对肽库进行筛选，并通过丢弃筛选所用离心管的方法去除聚苯乙烯PS材料对筛选带来的影响，最后对筛选得到的噬菌体克隆进行DNA测序和分析，并采用ELISA比较亲和性。3.权利要求1所述大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌的抗菌材料中的应用。4.权利要求1所述大...

【专利技术属性】
技术研发人员：王平，王宜冰，施凡，孙文，甘凌风，王超勇，刘晓骏，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31