本发明专利技术公开一种四种食源性致病菌多重PCR检测法及检测引物组和试剂盒。本发明专利技术通过利用分析设计得到的沙门氏菌、志贺氏菌、萄球菌和单增李斯特菌的快速检测引物组，对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单增李斯特菌。各检测引物组特异性强，能在同一反应体系中准确检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌基因组DNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌四重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌印/ )是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外， 该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。志贺氏菌5^)属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌I型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌 {Staphylococcus aareM)隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。单增李斯特菌(Zisteria Mwoatow/ ^)，是一种具有耐热 (600C )、耐低温)、耐盐、耐干燥等性质的食源性致病菌，1986年，WHO和FDA将其列为 20世纪90年代食品四大致病菌之一 ；2000年，被WHO化列为重点监测的食源性致病菌之一，目前也是我国重点关注的标准外微生物风险因子之一。根据现行的国家风险监测体系要求，有多类食品均需对这四种食源性致病菌进行检测以排除其污染。常规检测采用传统培养方法，每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，所涉及培养基品种繁多，检测周期可长达6d以上，且受到检测人员专业背景、检测经验等多种因素影响，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升，但目前所采用的常规单重PCR方法不能实现多种目的菌的同时检测，仍存在较大工作量。多重PCR技术能在同一 PCR反应体系内实现对多种目标DNA的同步快速扩增，为病原微生物的鉴定提供了快速，灵敏，特异的方法。鉴于多重PCR技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。二重和三重PCR检测屡有相关报道。但由于多重PCR影响因素复杂，不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及其比例等会产生复杂的综合效应，因此所同时检测的目标微生物种类越多，PCR体系建立的难度越大。经国内外文献查询，尚未见有多重PCR应用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌快速检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种四种食源性致病菌多重PCR检测法及检测引物组和试剂盒。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是本专利技术沙门氏菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。本专利技术志贺氏菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本专利技术金黄色葡萄球菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。本专利技术单增李斯特菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。本专利技术使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行多重PCR检测的方法是将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对反应液进行电泳分析判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。进一步地，本专利技术所述多重PCR反应按以下步骤进行(1)95 °C 预变性 5min ；(2)95°C变性30s，62-64°C退火30s，72°C延伸100s，共进行35个循环；(3)72°C延伸 7min，4°C保存。进一步地，本专利技术在进行所述多重PCR反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 03-0. 05 μ M，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 03-0. 05 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 15-0. 25μΜ，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.08-0. 12 μ Μ，并且，还包含有浓度为1.8-2. 2mM的Mg2+UO %(体积)的10XPCR缓冲液、浓度为0. 04-0. 06U/ μ L的DNA聚合酶、浓度各为0. 2-0. 3mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。本专利技术快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、四种阳性对照品、DNA聚合酶、 10XPCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、 下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列，所述四种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的标准菌株的基因组DNA。本专利技术快速检测试剂盒的2XPCR预混液中，包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水，其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 06-0. 1 μ M，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 06-0. 1 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 3-0. 5μΜ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 16-0. 24 μ Μ, Mg2+的浓度为3. 6-4本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种沙门氏菌的检测引物组，其特征是：其上游引物具有如ＳＥＱ Ｎｏ．１所示的序列，其下游引物具有如ＳＥＱ Ｎｏ．２所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜侃，张东雷，金燕飞，陈小珍，
申请(专利权)人：浙江省质量技术监督检测研究院，
类型：发明
国别省市：86
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