本发明专利技术公开了一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括DEPC水，5×RT缓冲液，反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，特点是反转录引物包括以下十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如SEQ?ID?NO.1～NO.12所示，PCR引物包括余下十九种腹泻致病菌、人DNA内参、反应内参的正反向PCR扩增引物、十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如SEQ?ID?NO.13～NO.66所示，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及腹泻致病菌的检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病，其发病率仅次于上呼吸道感染，在我国感染性腹泻发病率居所有传染病首位。感染性腹泻是我国的常见病和多发病，病因比较复杂，可由病毒、细菌和原虫引起，近年来时有暴发流行，已经成为当前世界上不断增多的公共卫生问题之一，因此亟需建立多种腹泻致病菌快速高效的诊断方法。目前，腹泻致病菌的传统检测方法主要包括以下几种:(I)粪便常规检查:粪便常规检查法是根据大便性状、粪便镜检、发病年龄及流行季节估计最可能的病原体。光镜镜检时，黏液便、脓血便或血便，可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、肠出 血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻；稀便、水样便，可有少量或无红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、隐孢子虫、气单胞菌等所致的腹泻，具有成本低，对实验室硬件要求低的优点，但是存在如下缺点:1)灵敏度低，常出现假阴性；2)准确性较低，易造成错诊或误诊。(2)病原学检查:即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点:成本低；对实验室硬件要求低。缺点:1)耗时长:一般需3-5天或更长；2)诊断效率低:只能单菌纯培养；对一些表型特征变异的病原体，用形态学经验很难辨别；此外，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制，导致假阴性的结果；3)工作量巨大:由于对每个抽检样品的每种菌都必须进行检测，工作量非常巨大，特别是部分对培养环境要求较为苛刻的菌，更加大了检测的工作量和难度。(3)血清学检查:应用最广泛的是酶联免疫技术(ELISA): —般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。优点:1)样品通量较高:利用96孔酶标板，一块平板可完成多个样品的检测；2)较敏感，利用酶联的特性，可将原来的抗原信号放大；3)快捷:在时间上，比传统的培养基微生物培养检查法要缩短很多；但也存在如下缺点:1)易出现假阳性:由于洗涤和抗原包被的操作，或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应，故易出现假阳性；2)耗时耗力:制作抗体是非常耗时耗力的工作；3)灵敏度不确定:实验的灵敏度取决于抗体的好坏，而每个抗体的好坏不一，质量难以控制；4)无法检测多变异的病毒:变异性较快的病毒，如一些RNA病毒，存在多种亚型，并且经常变异，变异导致抗体失效，无法检测抗原。(4)分子生物学——PCR检测方法:目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点:灵敏性高，并可精确定量，在对李氏杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004年，中国发布了实施荧光定量PCR检测禽流感H7亚型的国家标准。2009年，美国FDA批准了用荧光定量PCR检测猪流感HlNl亚型的试剂盒。但也存在如下缺点:1)通量低:一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手；2)成本相对较高:因一次只能检测一个病原体，当一个样品同时需要检测多种病原菌时，必须一个一个检测，成本相对增高。(5)分子生物学一基因芯片法:基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点:1)高通量并行检测:当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果；但也存在如下缺点:1)技术成本昂贵、复杂:每个样品需要一个芯片，成本大于YlOOO/样品，不利于大规模推广；2)探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3)不能精确定量，重复性差；4)灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。Gen0meLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了 96孔板的排列特性，降低·了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的表达,能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述腹泻致病菌的传统检测方法存在的缺陷，具有以下优点1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。2、准确性强:GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超闻灵敏度；4、方法简便，使用经济=GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化:就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒，包括DEPC水、5 X RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10 X PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，所述的反转录引物包括表I中十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表I中余下的十九种腹泻致病菌、人DNA内参、反应内参的正反向PCR扩增弓I物、上述i^一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表I所示。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒，包括DEPC水，5×RT缓冲液，反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的反转录引物包括表中十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表中余下十九种腹泻致病菌、人DNA内参、反应内参的正反向PCR扩增引物、上述十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表所示。
【技术特征摘要】
1.一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒，包括DEPC水，5 X RT缓冲液，反转录引物、反转录酶、X溶液、IOXPCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的反转录引物包括表中十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表中余下十九种腹泻致病菌、人DNA内参、反应内参的正反向PCR扩增引物、上述十一种腹泻RNA病毒与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表所示。2.根据权利要求1所述的一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒，其特征在于:所述的X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ；反向扩增弓丨物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用弓I物正向扩增引物带荧光标记。3.根据权利要求1所述的一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品为连接有设计上述三十种腹泻致病菌、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的PMD18-T的克隆载体。4.一种利用权利要求1所述的同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒的检测腹泻致病菌的方法，具体包括以下步骤: (1)采集样本并提取核酸 采集腹泻患者的粪便、呕吐物或血液的分离培养物，从分离培养物中提取核酸； (2)以患者核酸为模板进行RT反应 取5-20ng/ul的核酸样品RNA5 u L，DEPC水8 y L，5 X RT缓冲液4 y L，反转录引物溶液2 ii L,反转录酶I ii L混匀后加入到96孔样品板上进行反转录,反应条件:48° C...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴勇，陈燕芬，南丽，黄迎彬，
申请(专利权)人：海尔施生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。