多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3‑14所示的引物。本发明专利技术还提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明专利技术所述的多重PCR引物组和DNA聚合酶。通过上述技术方案本发明专利技术显著地提高了对五种致病弯曲菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法。
技术介绍
由弯曲菌属细菌感染引起的一系列疾病称之为弯曲菌病，临床上最常见的是由感染该菌所致的腹泻。弯曲菌广泛分布于自然界，可通过动物、食物、水、牛奶等传播人类发病。近年来，弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。弯曲菌感染人类能引起温和至严重的腹泻。在弯曲菌属中，对人类致病的绝大多数是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种(以下简称“胎儿弯曲菌”)，其次是结肠弯曲菌。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸟弯曲菌和胎儿弯曲菌占所有从人体分离的弯曲菌属细菌的99％(其中空肠弯曲菌占90％)。其它菌种，如乌普萨拉弯曲菌、简明弯曲菌等引起的感染也有报道，但所占比例极小。国际上对弯曲菌检测采用的标准有ISO 10272-1:2006《食品和动物饲料微生物学弯曲杆菌属检测和计数用水平方法第1部分：检测方法》和FDA/CF-SAN《细菌分析手册》(BAM)(第7章)。国内标准有国家标准GB/T4789.9-2008《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》和出入境检验检疫行业标准SN/T0175-1992《出口食品中弯曲杆菌检验方法》。这些标准均采用细菌分离培养、生化反应和血清学方法鉴定弯曲菌种属及血清型。整个检测获得最终结果需要5天左右，既费时又费力，且受限于数据库信息有限。同时，挑选菌落不全、菌落不纯、菌液浓度过高或过低均会影响最终结果的呈现。生物芯片可以对弯曲菌属、种和亚种进行系统的鉴定，但进行生物芯片检测需要配备昂贵的仪器，稳定性差、重现率低等技术难题和昂贵的成本仍是制约其进一步发展和应用的因素。分子生物学检测方法提高了检测的灵敏度和特异性，采用单重普通PCR或单重实时荧光PCR可以快速的鉴定弯曲菌种属。但是食品和临床标本成分复杂，提取后的核酸仍有可能带有PCR抑制成分，所以常出现假阴性的结果，造成弯曲菌的漏检。多重PCR技术可以很好的解决这些问题。但是当前普通的多重PCR技术会低于普通单重PCR和单重实时荧光PCR检测的灵敏度，对于微量致病弯曲菌的检测存在着较大的漏检风险；另一方面，普通PCR结果往往使用琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，此方法操作复杂，耗时间长，常常需要用到EB(溴化乙锭)等核酸染料，对实验人员存在安全隐患。因此有必要对现有的弯曲菌的检测方式进行改进，建立一种快速、特异且敏感地判定弯曲菌属及鉴别弯曲菌亚种的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有致病弯曲菌检测技术中存在的仪器平台昂贵、耗时长、敏感性和特异性差、检出率低和覆盖度差的问题，提供一种新的弯曲菌检测引物和方法。为达到以上目的，本专利技术提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、胎儿弯曲菌(C.fetus)、海鸟弯曲菌(Campylobacter laridis)、乌普萨拉弯曲菌(C.upsa liensis)和结肠弯曲菌(C.colic)。本专利技术的还提供了五种致病弯曲菌的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本专利技术所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有425bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有141bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有空肠弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有463bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有胎儿弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有293bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有海鸟弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有205bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有乌普萨拉弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有180bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有结肠弯曲菌。本专利技术还提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的引物组和DNA聚合酶。另一方面，本专利技术还提供了如上所述的引物组在制备检测五种致病弯曲菌的试剂盒中的用途；其中，所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。通过上述技术方案，本专利技术建立了弯曲菌属和各种的多重PCR检测引物组和检测方法，能够将检测时间从传统方法的3-5天缩短到2小时，达到如下的检测效果：(一)多重检测本专利技术所建立的检测方法能够在一次PCR反应中鉴定弯曲菌属的同时，筛查空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和胎儿弯曲菌。检测方法涵盖了当今世界发现的弯曲菌流行株和暴发株。2个小时内能快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。(二)特异性高本专利技术所建立检测方法的特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时特异性实验表明本专利技术的引物能够很好的区分与弯曲种属相近、生存环境相同的细菌，包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌O157、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(三)灵敏度高本专利技术所建立的检测方法具有与单重实时荧光PCR相当的检测灵敏度，在每一个反应体系中每个检测目标的检测灵敏度可达到103-104CFU/mL。(四)成本较低本专利技术所建立的多重PCR检测方法采用普通PCR原理，减低了使用荧光探针的高成本，同时保证检测效果。与普通单重PCR方法相比较，该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省90％的试剂成本；在操作性上一次反应检测6个目标基因，至少节省了50％的人力成本和时间成本，原来单重检测需要6次人工和6倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1个反应的时间。(五)预防假阴性结果本专利技术反应体系中添加的阳性内对照，除了可以验证操作失误造成假阴性结果外，还可以验证体系中是否含有PCR扩增反应的抑制剂造成的假阴性结果。本专利技术为五种弯曲菌快速筛查提供了整体的解决方案，能实现食物中毒事件发生和传染病疫情暴发后的弯曲菌种和亚种的快速鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。其中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3‑14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.15-16所示的引物。3.五种致病弯曲菌的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有425bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有141bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有空肠弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有463bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有胎儿弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有293bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有海鸟弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有205bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有乌普萨拉弯曲菌；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓艳，王彦威，王雷，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11