一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL‑RCA‑PCR检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL‑RCA‑PCR检测试剂盒及方法，所述引物为DogCV‑D‑F：GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT和DogCV‑D‑R：AGACTGAGCCGCCGATAGAG；所述试剂盒中包含上述引物。本发明专利技术中犬腹泻物样本仅采用DogCV引物PCR方法进行检测。该引物、CL‐RCA‐PCR试剂盒及检测方法的准确性高、特异性强、灵敏性高。

A primer for detection of canine circovirus and efficient CL RCA PCR detection kit and method

The invention discloses a primer for detection of canine circovirus and efficient CL RCA PCR detection kit and method, the primers for the DogCV D and DogCV F:GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT D R:AGACTGAGCCGCCGATAGAG; the kit containing the primer. In the present invention, canine diarrhea samples are detected only by DogCV primer PCR. The accuracy of CL primer, RCA PCR kit and the detection method of high specificity and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL-RCA-PCR检测试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测犬圆环病毒的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
犬圆环病毒(Dogcircovirus，DogCV，又称Caninecircovirus，CCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员，是一类无囊膜、单链环状DNA病毒。2012年，KapoorA等首次在犬血清样品(6/205)发现一种新型哺乳动物圆环病毒，将其命名为CaCV-1，并测定其全基因组序列。DogCV基因组长度约为2Kb，包含两个主要的开放阅读框(ORFs)，ORF1编码复制酶Rep蛋白，ORF2编码衣壳Cap蛋白。为了避免与已有的金丝雀圆环病毒(Canarycircovirus)和犬杯状病毒(caninecalicivirus)混淆，研究者建议将该病毒命名为DogCV。随后，DogCV陆续在美国和意大利被发现，并证实这种新的哺乳动物圆环病毒是引起犬坏死性血管炎、淋巴结肉芽肿和肠道综合症的致病因子之一。目前已报导的圆环病毒感染严重危害动物健康。在禽类中，圆环病毒感染能引起喙异常、嗜睡、厌食和鹅死亡的现象；在养猪业中，猪环病毒2型(PCV2)引起PMWS、呼吸和肠道疾病，皮炎与肾病综合症和繁殖障碍等问题，导致重大经济损失；在狐狸中，圆环病毒感染主要侵染神经系统，引起狐狸的淋巴浆细胞性脑膜脑炎。而Dogcv作为一种新的圆环病毒，其危害性也逐渐被人们认识。2013年Li等利用RealtimePCR方法检测了病犬和健康犬感染和携带DogCV的情况，发现腹泻犬和健康犬粪便阳性率分别为11.3％(19/168)和6.9％(14/204)；患血小板减少症、中性粒细胞减少症、不明发热症状或被蜱叮咬过的犬血清阳性率为3.3％(19/409)。结合病理剖检、原位杂交和电镜检查结果表明，DogCV与PCV2感染在临床症状和病理变化上均非常相似，主要侵害淋巴细胞，并能在淋巴细胞或巨噬细胞胞浆内形成包涵体，推测该病毒单独或与其它病原体共感染造成犬疾病和死亡。2014年Nicola等在对2009年采集样品进行回溯性调查就检测出了该病毒。2016年Han等也利用RealtimePCR方法对于2012年6月-2014年6月从台湾地区收集的犬样品进行了检测，结果发现腹泻犬和健康犬粪便阳性率分别为28.0％(58/207)和11.9％(19/160)。同年，Thai等发现DogCV与犬细小病毒2(CPV-2)存在共感染，且利用原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)在犬淋巴组织的细胞质和细胞核中检测到大量的犬圆环病毒核酸，并发现DogCV感染的犬只出现淋巴细胞耗竭现象，这可能表明DogCV能引起免疫抑制。随后，孙文超等采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列，且通过遗传进化树分析显示该毒株与在美国、欧洲流行的毒株处于不同的分支。因而，对国内犬开展该病毒的检测及其基因组分析刻不容缓，常规PCR更适用于不具备荧光定量PCR仪的检测条件。然而使用已报道的PCR引物对犬血液样品进行检测存在不敏感或特异性低的缺点，推测可能是犬圆环病毒的靶核酸信号低、引物与病毒靶基因不匹配或病毒DNA含量低等原因导致。因此建立设计一种特异性的引物和新的DogCV常规PCR检测与连接封闭(completionandligation，CL)、体外滚环扩增(Rolling-circleamplification，RCA)组合方法，以实现对国内DogCV毒株快速、可靠的检测。圆环病毒基因组是单链闭合环状的DNA，通过滚环复制完成其基因组的复制。圆环病毒侵入细胞后，单链闭合环状的DNA被补上互补链形成其双链的复制中间体(dsDNA)，而转录酶翻译出来的Rep蛋白可以在双链DNA上打一个缺口(nick)，形成开环dsDNA，然后借助细胞核的DNA多聚酶，以滚环复制(rollingcirclereplication，RCR)的方式来复制圆环病毒基因组(线性互补DNA)，最终通过细胞内连接酶完成单链基因组的连接闭合。圆环病毒感染后中可能存在4种DNA形式：单链闭合环状DNA、闭合dsDNA、开环dsDNA、不闭合线性DNA。滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。需以环状DNA为模板，通过一个短的、与部分环状模板互补的六聚体随机引物，在DNA聚合酶作用下将dNTPs转变成延伸的单链DNA，产生一条具有大量重复的模板互补片段的线性单链。已有研究表明利用RCA技术能够放大环状DNA病毒的核酸信号，而且病毒样品经RCA后，可将其产物做为模板再进行PCR，这样病毒检出率更高，表明RCA-PCR比常规PCR检测灵敏性更高。但目前还没有利用该原理检测犬圆环病毒的引物、试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL-RCA-PCR检测试剂盒及方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述用于检测犬圆环病毒的引物如下：DogCV-D-F：GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT(SEQIDNO.1)；DogCV-D-R：AGACTGAGCCGCCGATAGAG(SEQIDNO.2)。所述高效CL-RCA-PCR检测试剂盒中包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物，还包括随机引物。所述试剂盒中还包括离心吸附柱、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、CL反应试剂、RCA反应试剂、PCR反应试剂、DNAMarker、TAE缓冲液、溴化乙锭、琼脂糖、阳性对照为DogCV阳性的DNA样本、阴性对照为DogCV阴性的DNA样本；所述溶液A由150mMTris-NH4Cl、10mMKHCO3、1mMNa2EDTA组成，所述溶液B由10mMTris-HCl、10％的SDS、750mMCH6ClN3组成，所述溶液C为体积百分比浓度为70％的C2H5OH，所述溶液D由10mMTris-HCl和1mMEDTA组成。所述检测犬圆环病毒的方法是利用上述试剂盒，先通过T4DNApolymerase和T4DNAligase对样本中圆环病毒的开环dsDNA和不闭合线性DNA进行连接封闭成为闭合环状结构，使样品中环状DNA的模板数量增加，然后再将CL产物进行RCA扩增，最大化的富集犬圆环病毒的靶核酸，最后将此CL‐RCA产物为模板，进行常规PCR检测。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术试剂盒包含：1.DNA提取试剂盒，其中的成分包括以下几种成分：1)离心吸附柱2)溶液ATris-NH4Cl150mMKHCO310mMNa2EDTA1mM3)溶液BTris-HCl10mMSDS10％(M/V，M的单位为g，V的单位为mL)CH6ClN3750mM4)溶液CC2H5OH70％(V/V)5)溶液DTris-HCl10mMEDTA1mM2.CL反应试剂Phi29DNA聚合酶缓冲液(购自NewEnglandBiolabs公司，美国)，0.1mg/mLBSA，0.5mMdNTP，lmMATP，1.5UT4DNApolymerase(NEB公司，美国)，200UT4DNAligase(NEB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测犬圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物如下：DogCV‑D‑F：GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT；DogCV‑D‑R：AGACTGAGCCGCCGATAGAG。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物如下：DogCV-D-F：GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT；DogCV-D-R：AGACTGAGCCGCCGATAGAG。2.一种高效CL-RCA-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1所述的引物。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括随机引物。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括离心吸附柱、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、CL反应试剂、RCA反应试剂、PCR反应试剂、DNAMarker、TAE缓冲液、溴化乙锭、琼脂糖、阳性对照为DogCV阳性的DNA样本、阴性对照为DogCV阴性的DNA样本；所述溶液A...

【专利技术属性】
技术研发人员：王乃东，张佳鑫，杨毅，王爱兵，邹亚文，屠迪，杨凌宸，邓治邦，张南乡子，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43