一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。优选的是，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG、POL和LTR区。本发明专利技术设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型（包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型），并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量，其检测灵敏度可达50IU/ml，定量线性范围为50~1.0×108IU/ml。本发明专利技术另外提供一种HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这六套中的任意一套。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于诊断试剂
，具体涉及一种人类免疫缺陷病毒Hiv-1的荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus, HIV)感染而引起的疾病，又称艾滋病。该病患者的免疫功能部份或完全丧失，⑶4+细胞(cd4和cd8是T淋巴细胞上的抗原蛋白质，其中cd4+称为辅助性T细胞)数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。1981年世界报告首例艾滋病病例至今，在短短30年间，艾滋病已肆虐全球，夺去2500多万人的生命。联合国艾滋病规划署21日发布年度报告，全球2010年艾滋病病毒(HIV)携带者大约3400万人，比2009年增加70万。自1985年我国发现首例艾滋病病人以来，我国艾滋病感染人数逐年上升。中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心数据显示，我国累计报告艾滋病病毒感染者 和病人43.4万人，其中死亡8.8万人。据联合国艾滋病规划署、世界卫生组织和卫生部联合专家组评估，截至2011年底，估计我国存活艾滋病感染者和病人78万。HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分尚和病毒成份(如抗原、核酸)的检测。实验室检测包括病毒蛋白抗体检测、抗原检测、病毒分离培养、核酸检测等方法。其中，抗体检测的初筛试剂主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA);ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次；确认试剂通常采用Western blot (WB,蛋白印迹法)，即用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经转移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gpl20、gp41、P24抗体，特异性较高。抗原检测则用ELISA检测P24抗原，在HIV感染早期尚未出现抗体时，血中就有该抗原存在；但由于P24量太少，阳性率通常较低；现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原来提高敏感性。病毒分离培养的常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞进行共培养。核酸检测是用PCR法或基于转录的系列复制方法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。艾滋病病毒进入人体后，机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3-6周后才能被检测出来。而近几年发展起来的艾滋病核酸检测技术是检查病毒本身的技术，感染七天之后就能检测出来，残余风险度大大下降，能够提前预防，比传统的试纸检测更精确，时间上更为提前。PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使其在使用上收到一定限制。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和erw基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等；其中前述三个基因为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性。第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达。第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr。根据HIV基因结构、免疫学和流行病学的特征，HIV被分为HIV-1和HIV-2两大类，HIV-1的感染力较强，在世界各地广为流行，而HIV-2主要集中在非洲西部、欧洲、美国，南美的一些地区也偶有报道。在进化树上，HIV-1主要分为三群(group)，分别用Μ、O和N表示，M的含义是“major”，是全球HIV-1流行的主要形式，超过90%以上的感染属于HIV-1M群。O是“outlier”的意思，O群主要集中在中非，占整个HIV-1感染者的比例不足5%，N代表“non Mnon B”的意思，全球感染仅在局部地区有报道。HIV-1M群内按照基因序列的差异，又可分为不同的亚型(subtype)，目前已经明确HIV-1 M群分为9个亚型，按照发现的先后次序用英文字母A D、F H、J和K来表示，E和I亚型已证实为不同亚型重组的产物，所以取消这两种亚型。流行重组型(circulating recombinant form, CRF)是指由不同亚型之间基因相互重组形成的新的具有感染性的重组病毒形式。造成CRF出现的原因除了基因自身突变形成HIV-1基因的变异之外，不同病毒感染同一个细胞后造成DNA序列重组是主要原因。病毒重组后形成新的CRF，重组可发生在HIV不同或相同亚型间，由于重组后的病毒基因组中含有大段的来自不同亲本的基因，所以更容易改变重组毒株的遗传特性和生物学表型，但大部分重组株可能产生缺损毒株，不能造成传播或成为独特重组型(unique re-comb inantform, URF)病毒，将逐渐在人群中消失。只有那些因重组而获得生物学表型优势的重组株才能在人群中广泛传播，进而成为CRF。最常出现重组的位置是gag区和env区，目前至少有34个不同的流行重组型(CRF)。 HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gpl20的五个区段，gag和pol基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性。目前普通的荧光定量PCR检测技术，仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型，它仅能检测几种主要的型别，比如A、B、C、B/C、A/E，其后果是产生漏检或各亚型间的定量不准确。目前国内已有的HIV荧光定量PCR检测试剂不多，仅有3-4种，且检测灵敏度低，约在1000IU/ml左右；对于低值(小于1.00E+03IU/ml)的样本无法检出或者无法准确定量，不能满足临床检测的需求。国外性能优异的同类试剂是Roche (罗氏)公司的“RocheAmpliPrep-Cobas TaqMan HIV_lTest”诊断系统,使用Iml的样本量,应用磁珠法原理采用全自动化的仪器进行RNA提取，然后自动加样进行RNA的荧光PCR扩增，实现临床样本中HIV-RNA的定量检测。该诊断系统具有自动化程度高、操作简便、检测灵敏度高(大于40copies/ml)等优点；但是样本需求量(Iml)太大，而且全自动化操作的试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。
技术实现思路
本专利技术提供一种人类免疫缺陷病毒HIV核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。

【技术特征摘要】
1.一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区:GAG基因、POL基因和LTR区。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LTR中的引物探针序列为LTRl或LTR2，所述GAG中的引物探针为GAGl或GAG2，所述POL中的引物探针序列为POLl或P0L2;且其序列分别如下:LTRl: 上游引物 LTR-Fl:5’ -AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’， 下游引物 LTR-Rl:5’ -AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，探针 LTR-Pl:5’ -AGTCACACAACAGACGGGCACACACT-3’ ；LTR2: 上游引物 LTR-F2:5’ -CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’， 下游引物 LTR-R2:5’ -GGCGCCACTGCTAGAGATT-3’，探针 LTR-P2:5’ -ACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC-3’ ；GAGl: 上游引物 GAG-Fl:5’ -AGCCCAGAAGTAATACCCATGTT-3’， 下游引物 GAG-Rl:5’ -CATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’，探针 GAG-Pl:5’ -CATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3’ ；GAG2: 上游引物 GAG-F2:5’ -GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGA-3’， 下游引物 GAG-R2:5’ -GGTTCTCTCATCTGGCCTGGT-3’， 探针 GAG-P2:5’ -TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’ ；POLl: 上游引物 POL-Fl:5’ -GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’， 下游引物 POL-Rl:5’ -ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，探针 POL-Pl:5’ -TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3’ ；P0L2: 上游引物 P0L-F2:5’ -CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT-3’， 下游引物 P0L-R2:5’ -ATCCTCATCCTGTCTACCTGCCA-3’，探针 P0L-P2:5’ -CAATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCATA-3’。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中使用的引物探针序列为LTRl和POLl。5.根据权利要求广4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RNA提取溶液I IV，其中， RNA提取溶液1:由十二烷基硫酸钠0.2 1.0% (质量/体积)、曲拉通1.(Γ4.0% (体积/体积)，异硫氰酸胍0.2l.0mol/L和10(Γ400 μ g/ml的磁珠组成； RNA提取溶液I1:包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸10(T300mmol/L、氯化钠10(T300mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，熊晓燕，邓中平，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：