本发明专利技术公开了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法，一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：10×ThermoPol?Reaction缓冲液；Bst?DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBR?Green?I。本发明专利技术具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞，非常适用于KHV的现场快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类病毒检测
，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法。
技术介绍
1998年5月在以色列的Magan Michael地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，同年成功分离出了病原锦鲤疱疫病毒(Koi herpes virus, KHV),为疱疫病毒科(Herpesviridae),鲤疱疫病毒属(Cyprinid herpesvirus)成员，又称鲤疱疫病毒III型(CyHV-1II)。锦鲤疱疫病毒病迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至我国，近年来给我国框镜鲤、鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、PCR、ELISA、原位杂交技术等，聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。但是这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号W000/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。专利技术内容本专利技术的一个目的是在于提供了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的KHV毒株的TK基因编码区序列(DQ177346)，应用PrimerExplorer V4(http://primerexplore r. jp/elamp4. O. 0/index, html)在线软件设计特异性引物,利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对锦鲤疱疹病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞(例如Ko1-Fin细胞)，非常适用于KHV的现场快速检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBRGreen I (Invitrogen)0F3 :5，-GCATCGCCGTCAAGCAC-3，；B3 :5’-GCAGCTGCACGACTCC-3’ ；FIP :5’-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3’ ；BIP :5’-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3’。一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是1、病毒DNA的获取采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。2、LAMP 扩增采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和B3各 O.1 μ M，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl22-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。选择55_65°C的温度范围和30-120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000X SYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。3)取扩增产物，用2% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则`结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法(最佳条件)，其步骤是1、病毒DNA的获取采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。2、LAMP 扩增采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ L·反应管于62°C温育60分钟进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。3)取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点1、特异性好，能有效检测出锦鲤疱疹病毒；2、快速高效，检测时间约I小时，非常适用于KHV的现场快速检测；3、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；4、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000XSYBR Green I,可提高结果的灵敏度。附图说明图1为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。从左至右的泳道依次为空白对照(水)、鳗疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型、GSIV、KHV、DL2,OOOMarker0图2为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。从左至右的泳道依次为Ifg KHVUOfg KHVUOOfg KHVUpg KHVUOpg KHVUOOpgKHVUng KHV, DL2000DNA Marker。具体实施方式下列实例进一步说明本专利技术，但不应该当做对本专利技术的限制。若无特别说本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol?Reaction?缓冲液；Bst?DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBR?Green?I;F3：5，??GCATCGCCGTCAAGCAC???3，；B3：5，??GCAGCTGCACGACTCC??3，；FIP：5，?AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA???3，；BIP：5，?ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC???3，。
【技术特征摘要】
1.一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 该试剂盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction缓冲液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ;外引物卩3和83、内引物？1卩和81卩、86七&11^，]/%(12，1000/3￥81 Green I;F3 :5’_ GCATCGCCGTCAAGCACB3 :5’_ GCAGCTGCACGACTCC -3’ ；FIP 5'-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACABIP 5'-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC2.利用权利要求1所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是 1)、病毒DNA的获取 采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA ； 2)、LAMP扩增 采用25μ I反应体系内引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O.1 μ Μ，dNTPsImM, BetaineO. 5M, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾令兵，张辉，周勇，徐进，范玉顶，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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