用于预防锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病的重组KHV和疫苗制造技术

本发明专利技术涉及重组锦鲤疱疹病毒(KHV)、用于生产此类KHV的方法、包含此类KHV的细胞和此类KHV作为载体和在预防和/或治疗性处理鱼中由鲤鱼诸如普通鲤鱼或锦鲤中的锦鲤疱疹病毒引起的疾病中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于预防锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病的重组KHV和疫苗本专利技术涉及重组锦鲤疱疹病毒(KHV)、用于生产此类KHV的方法、包含此类KHV的细胞和此类KHV作为载体和在预防和/或治疗性处理鱼中由鲤鱼诸如普通鲤鱼(Cyprinuscarpiocarpio)或锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)中的锦鲤疱疹病毒引起的疾病中的用途。普通鲤鱼是主要在亚洲、欧洲和中东最广泛养殖的供人食用的鱼。相比之下，在全世界，尤其在日本，培育锦鲤亚种作为用于个人爱好或竞赛性展览的宠物鱼。1996年在英国检测到一种在普通鲤鱼和锦鲤两者中引起致死疾病的病毒，其最初被称为锦鲤疱疹病毒病(KHVD)。然后该病毒被迅速确认为在以色列、美国和德国的锦鲤和普通鲤鱼中大量死亡的原因。普通鲤鱼的密集养殖、锦鲤展览和国际贸易已经促进了这种高度传染和毒力极高的疾病的全球迅速传播。由于其出现，KHVD已经在全球锦鲤和普通鲤鱼养殖业中引起了严重的金融和经济损失。病毒的初步表征显示疱疹样结构，具有包膜和壳状结构围绕的100-110nm的二十面体电子致密核心。病毒的基因组包含约~295kb的线性双链DNA(dsDNA)，与鲤疱疹病毒1(CyHV-1)相似，但大于大小通常为125-240kb的疱疹病毒成员的那些。KHV基因组序列最近已经公布(Aoki等人,JVirol,81,pages5058-5065(2007))。KHV基因组含有显著量的与任何其它已知病毒序列无同源性的DNA序列。此外，其含有高度分歧(highlydivergent)的编码多肽的DNA序列，其与几种dsDNA病毒(如疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒和其它大型DNA病毒)的那些类似。该病毒的独特特征已经导致了三种不同的命名：首先，根据其形态表现命名为锦鲤疱疹病毒(KHV)；其次，根据其在鱼类中的致病作用命名为鲤间质性肾炎和鳃坏死病毒(CNGV)；最后，根据与CyHV-1和与CyHV-2的基因内容相似性命名为鲤疱疹病毒3(CyHV-3)。最后的命名已经得到最新的病毒基因组全长测序的进一步支持。然而，以下将使用名称KHV。KHV具有约295kb的基因组，其代表疱疹病毒成员中曾经鉴定的最大基因组。尽管首次分离KHV始于1996年，但关于个别基因在KHV发病机理和感染天然宿主的生物学中的作用只获得很少的信息。国际专利申请WO2004/061093A1中已经描述了减毒KHV及其作为疫苗候选物的潜在用途。然而，该疫苗候选物隐藏了潜在的危险。减毒是病毒体外复制过程中发生的随机突变的结果。因此，减毒的特征是未知的，且不能排除其回复到完全致病表型。KHV的应用研究和基础研究需要产生重组病毒。最近，通过使用细菌人工染色体(BAC)载体使操作大疱疹病毒基因组变得可行(Messerle等人,ProcNatlAcadSciUSA,94,14759-14763(1997)；Wagner等人,TrendsMicrobiol,10,318-324(2002)，参见下文)。这些载体允许在大肠杆菌(E.coli)中维持和有效诱变病毒基因组，随后通过用BAC质粒转染进入真核允许细胞中来重构子代病毒颗粒。迄今为止，几种疱疹病毒的基因组已经作为感染性BAC克隆成功繁殖，包括人巨细胞病毒(HCMV)，其代表迄今为止作为BAC克隆的第二大疱疹病毒基因组(230Kb)(Borst等人,JVirol,73,8320-8329(1999))。最近，已经使用BAC技术首次构建了几种重组KHV；这些重组体都描述于PCT专利申请WO2009/027412。该专利申请公开了制备在选自以下的一种或多种基因中具有缺陷的重组KHV的方法：ORF55：胸苷激酶基因；ORF12：推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因；ORF16：推定的G-蛋白偶联受体(GPCR)基因；ORF134：推定的白介素10同源基因；ORF140：推定的胸苷酸激酶基因，或它们的组合。此类突变体被用作活减毒疫苗病毒。显示这些突变体中的一些当在一定大小和鱼龄的特定SPF鱼中使用时是安全的。然而，在现场，渔民对早期疫苗接种感兴趣，即当鱼相对年幼/小时和鱼的大小存在比较大的分布的情况下。结果是，在此类条件下，基于如国际专利申请WO2009/027412中公开的缺失突变病毒的疫苗在一些情况下可能不是足够安全的：此类重组KHV对于在年幼/小鱼中使用毒性太强。这意味着，目前，仍然缺乏用于控制现场情况诸如鱼养殖中的安全且有效减毒的重组疫苗。本专利技术的一个目的是提供可用于开发在现场控制KHV感染的安全且有效的减毒疫苗的新型重组KHV病毒。现在令人惊讶地发现，开放阅读框57(ORF57)缺陷的重组KHV显示强烈降低的死亡率或完全没有死亡，甚至在这种疱疹病毒重组体感染的非常年幼/小鲤鱼中也是如此，并提供针对野生型锦鲤疱疹病毒的免疫。此类重组KHV因此提供了可以合适地在年幼和/或小鲤鱼中使用的安全且有效的减毒疫苗病毒。鉴于ORF57是到目前为止被认为是必需基因(没有活病毒在没有它的情况下是可行的)的事实，该发现甚至更令人惊讶。因此，本专利技术的第一实施方案涉及ORF57缺陷的重组锦鲤疱疹病毒，导致产生减毒的KHV并当用所述疱疹病毒感染时，诱导鲤鱼优选普通鲤鱼或锦鲤中40％或更少的死亡率。如本文所用，“缺陷的”ORF57是不再有功能，即不再能够编码功能蛋白的ORF57。如本文所用，缺陷ORF57导致产生以下KHV：其被减毒至其在鲤鱼中诱导40％或更低的死亡率的水平。此类缺陷可以例如通过突变诸如编码ORF57的基因中或其启动子区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而获得。此类突变可以例如是基因的5'位点的移框突变，或启动子区域(的一部分)或基因本身(的一部分)的缺失。ORF57的DNA序列的实例是如Genbank登录号NC_009127给出的ORF57的DNA序列，其中ORF57起始和终止密码子位于位置99382和100803。不言而喻，ORF57的位置可能由于自然变异在其它KHV毒株中不同。另外，由于自然变异，当与另一种KHV毒株比较时，一种KHV毒株中的ORF57序列中可能存在小差异。因此，如本文所述的ORF57是与如Genbank登录号NC_009127给出的ORF57的DNA序列具有大于80％的序列同一性的开放阅读框。横跨核苷酸96630-101558的包含ORF56、57和58的核苷酸区域表示在SEQIDNO:12中。还参见图1。清楚的是，制备基因缺陷，即整个ORF57缺失，的最广泛的方法将导致完全没有ORF57蛋白产生。从实用的角度和安全的观点来看，此类完全缺失将是采取的合乎逻辑的步骤。然而，如下从图1来看，推定的启动子区域位于可能参与相邻ORF58的表达的位置100212-100261。出于这个原因，ORF57中的突变应当优选不延伸进这个区域。因此，优选在位置100212的左手侧或位置100261的右手侧的区域中引入ORF57中的突变。从图1还可以看到，两个推定的启动子区域分别位于可能参与相邻ORF56的表达的位置99451-99500和位置99794-99843。因此，ORF57中区域中的缺失干扰ORF56的表达在理论上是可能的。在那种情况下，可能根据本专利技术的ORF57缺陷的重组KHV仅仅由于本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组锦鲤疱疹病毒(KHV)，其中开放阅读框57 (ORF57)是缺陷的，导致产生减毒的KHV。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.30 EP 11196171.01.活重组锦鲤疱疹病毒(KHV)，其中开放阅读框56(ORF56)和开放阅读框57(ORF57)是缺陷的，产生减毒的活重组KHV。2.根据权利要求1的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，所述活重组锦鲤疱疹病毒在至少一种额外的基因中是缺陷的，所述基因对毒力有贡献，但对于复制不是必需的。3.根据权利要求2的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，所述至少一种额外的基因选自胸苷激酶基因；ORF12：推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因；ORF16：推定的G-蛋白偶联受体(GPCR)基因；ORF134：推定的白介素10同源基因和ORF140：推定的胸苷酸激酶基因。4.根据权利要求1-3中任一项的活重组锦鲤疱疹病毒，其包含BAC(细菌人工染色体)载体序列。5.根据权利要求4的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，从所述疱疹病毒基因组中切除BAC载体序列的部分，从而分别在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点留下异源DNA片段，其中从所述疱疹病毒基因组中切除的BAC载体序列的部分包含至少一种编码选择标记的基因和/或抗性基因。6.根据权利要求1-3和5中任一项的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，其进一步包含异源DNA片段。7.根据权利要求4的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，其进一步包含异源DNA片段。8.根据权利要求6的活重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于，所述异源基因是编码引起鲤鱼春季病毒血症的棒状...

【专利技术属性】
技术研发人员：AFC范德普拉斯臣，
申请(专利权)人：列日大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE