鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用。该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C2013179。该异育银鲫脑组织细胞系生长状态良好，对目前难以用常见鱼类细胞系培养的CyHV-2敏感；CyHV-2在GiCB细胞上连续传代至第6代仍可检测到病毒核酸且细胞病变稳定；将出现病变效应的细胞做超薄电镜切片，可在GiCB细胞中观察到大量CyHV-2成熟病毒粒子及其复制过程。本发明专利技术所构建的异育银鲫脑组织细胞系的构建方法重复性强，条件科学合理，适用于体外培养鲤疱疹病毒Ⅱ型，为鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离、检测、培养及其完整的生物学特性研究提供了技术平台。

【技术实现步骤摘要】
鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用
本专利技术属于水生生物细胞领域和水产养殖病害防控
，具体涉及鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系，还涉及该细胞系的建立方法，还涉及该细胞系的应用。
技术介绍
鲤疱疫病毒II型(Cyprinid herpesvirus II, CyHV-2)又被称为疱疫病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV)或金鱼造血器官坏死病毒(Goldf ish haematopoietic necrosis virus, GFHNV),与鲤科鱼类的其他两种疱疫病毒 CyHV-1 (Carp pox)和 CyHV-3 (Koi herpesvirus, KHV)同属 Alloherpesviridae科，Cypriniviruse属。CyHV-2于1995年首次被报道，1992~1993年间给日本西部养殖的金鱼造成巨大的经济损失，患病金鱼死亡率高达100%。随后其他国家和地区也相继有了该病暴发的报道，1997年春季在美国西海岸一用循环水养殖的金鱼幼鱼出现大量死亡，死亡率高达80%以上，后经证实是由CyHV-2感染。观赏鱼的国际贸易很大程度上促进了该病的全球传播，随后我国台湾、澳大利亚、英国养殖的金鱼相继暴发该病。2011年匈牙利报道了养殖的银鲫也发现了 CyHV-2感染。2009年起，在我国鲫鱼的主要养殖区江苏省暴发了由CyHV-2引起的鲫鱼造血器官坏死病，截至2012年6月中旬，江苏省内射阳、大丰、盐都、宝应、高邮、兴化、洪泽、楚州等地病害发生面积超过10万亩，发病塘口的死亡率高达90%，造成的经济损失已达数亿元。与此同时，在湖北、湖南、江西、黑龙江等省份，也相继在患病鲫鱼体内检测出CyHV-2。该病毒传染性强、致死率高，给鲫鱼、金鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁鲫鱼、金鱼养殖业的发展。细胞培养分离技术是最准确的病毒病诊断方法，通常是世界动物卫生组织(OIE)推荐的鱼类病毒检测的首选方法。但已有研究发现CyHV-2很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中进行增殖。胖头鲤细胞(`fathead minnow cells, FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma popuasum cuprini, EPC)、獲鲡肾细胞(eel kidney, EK-1)、鲑鱼胚胎细胞(chinook salmon embryo, CHSE-214)、虹蹲鱼性腺细胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和罗非鱼卵巢细胞(tilapia ovary，T0-2)均对CyHV-2不敏感，仅锦鲤鳍细胞(koi finl，KF-1)能产生细胞病变效应(CPE)，但病毒在KF-1细胞上传至第3代后，CPE消失且检测不到病毒核酸。由于缺乏CyHV-2敏感的细胞系，限制了对CyHV-2的研究，因此建立对CyHV-2敏感的细胞系并研究该细胞系的生物学特性，对CyHV-2进行连续传代扩大培养从而深入研究病毒的特性，具有重要的意义。本专利技术建立了用于分离培养鲤疱疹病毒II型的敏感细胞系GiCB，该细胞系的应用还包括但不局限于:分子细胞水平上开展鲤疱疹病毒II型及其他鱼类病毒理化特性、形态发生、病毒感染途径、感染机理；制备、筛选或评价鱼类抗病毒药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系。该细胞系可用于分离，检测，分离培养鲤疱疹病毒II型病毒。该细胞系已于2013年11月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:异育银鲫脑组织细胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏编号:CCTCC NO:C2013179,地址:中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的建立方法，方法简单，易行。本专利技术最后一个目的在于提供了一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的应用。该细胞系可以用于分离、检测和培养鲤疱疹病毒II型；用于对CyHV-2进行体外连续传代、扩大培养从而深入研究该病毒的特性。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施:一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的建立方法，步骤如下:(I)脑组织的处理:无菌条件下取出异育银鲫脑组织，无菌处理为50~IOOmm3的组织块；(2)原代培养:将步骤(1)中的组织块放入组织分离专用胰蛋白酶消化液中消化10~15min，期间震荡3~4次，加入等体积的异育银鲫脑组织细胞专用培养液(以下简称为培养液)，吹打均匀，离心收集经消化处理的细胞，吸弃上清，添加培养液，吹打细胞沉淀，将制成的细胞悬液加入细胞培养瓶中培养，每2天半量更换培养液一次；(3)传代培养:原代培养异育银鲫脑组织细胞长成单层后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟， 用培养液悬起细胞，按I瓶传2瓶的方式进行传代培养。待细胞再次形成单层后，按照上述的细胞的传代培养方法进行下一次传代培养，得到来源于异育银鲫脑组织的鲤疱疹病毒II型敏感细胞系GiCB，该细胞系已于2013年11月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:异育银鲫脑组织细胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏编号:CCTCC NO:C2013179,地址:中国武汉武汉大学。异育银鲫脑组织细胞系GiCB，为成纤维细胞样细胞，最佳培养基为M199，最适血清体积分数为20% (V/V)，最适培养温度为25°C。GiCB细胞经液氮冷冻后复苏，通过染色，约80%的细胞具有细胞活性，并保持原有生长状态，该细胞已经稳定传代65次。所述的组织分离专用胰蛋白酶消化液为0.5%~0.7%W/V胰蛋白酶消化液，细胞培养、传代的温度为25~28°C，pH值7.0~7.4。所述的异育银鲫脑组织细胞专用培养液为含有10~20%V/V胎牛血清、10~20ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10~20ng/ml人表皮细胞生长因子、100U/ml青霉素、100 u g/ml链霉素、0.25 u g/ml两性霉素B，pH值7.0~7.4的M199培养液。一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的应用，包括该细胞系在鲤疱疹病毒II型培养上的应用；该细胞系在鲤疱疹病毒II型检测上的应用；该细胞系在鲤疱疹病毒II型分离上的应用；该细胞系在制备鲤疱疹病毒II型病疫苗上的应用；该细胞系在其他鱼类病毒分离检测上的应用；该细胞系在作为抗鲤疱疹病毒II型药物筛选生物模型上的应用；该细胞系在鱼类细胞的基因转染和研究基因功能上的应用。所述的鲤疱疹病毒II型为鲤疱疹病毒II型野生毒株或已报道的鲤疱疹病毒II型分离株。利用巢式PCR检测方法，对在GiCB细胞上进行连续传代的鲤疱疹病毒II型DNA检测验证，结果证实在GiCB细胞连续传代第6代仍可检测到病毒核酸；细胞病变效应(CPE)稳定且明显；将出现病变效应的细胞做超薄电镜切片观察，透射电镜结果显示，在GiCB细胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其复制过程，证明CyHV-2在G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系，其特征在于：异育银鲫脑组织细胞系（Gibel?carp,?Carassius?auratus?gibelio）GiCB，CCTCC?NO：C2013179。

【技术特征摘要】
1.一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系，其特征在于:异育银鲫脑组织细胞系(Gibel carp, Carassius auratus gibelio) GiCB, CCTCC NO:C2013179。2.权利要求1所述细胞系的建立方法，具体步骤如下: (1)脑组织的处理:无菌条件下取出异育银鲫脑组织，无菌处理为5(T100mm3的组织块； (2)原代培养:将步骤(1)中的组织块放入组织分离专用胰蛋白酶消化液中消化l(Tl5min，期间震荡3~4次，加入等体积的异育银鲫脑组织细胞专用培养液，吹打均匀，离心收集经消化处理的细胞，吸弃上清，添加培养液，吹打细胞沉淀，将制成的细胞悬液加入细胞培养瓶中培养，每2天半量更换培养液一次； (3)传代培养:原代培养异育银鲫脑组织细胞长成单层后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟，用培养液悬起细胞，按I瓶传2瓶的方式进行传代培养，待细胞再次形成单层后，按...

【专利技术属性】
技术研发人员：马杰，曾令兵，江南，陈倩，赵辉，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：