表皮细胞的动态富集方法技术

本发明专利技术涉及一种表皮细胞的动态富集方法，属于生物细胞技术领域。包括预处理、消化和配液，取表皮，制成若干块表皮片，将表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液即可喷涂在创面上。将本发明专利技术动态富集方法应用于创面修复，具有培养效率高、操作便捷、皮源利用率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于生物细胞
。
技术介绍
我国烧伤的发病率为总人口的2~10%。，每年发生烧伤者近千万人，需住院治疗的达数十万之多，而且，严重烧伤者死亡率很高。烧伤治愈后常遗留大量疤痕，对患者的外貌、体形以及功能、心理方面都会造成负面影响。其中，大面积烧伤造成严重的皮肤缺失，是导致患者死亡的一个重要因素，皮源的解决问题的关键。 为了克服皮源的问题，通常是采用尽早关闭烧伤创面的方法，烧伤创面的早期关闭不仅可以挽救患者生命，也是减轻疤痕的重要手段，现有的技术中主要是通过微粒皮技术、培养表皮细胞以及Recell技术来实现的。(I)微粒皮技术需先从患者身下未烧伤部位取下健康的皮源，再将这有限的自体皮源使用物理方法进行分散成尽量小的微粒，然后回植到病人的创面上，这种技术可将皮片扩大10~20倍，但该方法采用物理方法将皮片粉碎，然后回植到创面上，移植的皮粒贴附率不高，因此，效果难以保证；(2)培养表皮细胞的方法需等待的时间较长，且远期疗效不佳；(3) Recell技术是在静态下通过胰酶将基底层表皮细胞进行消化，然后利用喷雾法将混悬在林格氏液中的液态表皮细胞喷洒在创面，使用该技术可将皮片扩大40~60倍，但缺陷在于，该方法需要消耗大量的高浓度消化酶，处理过程中会采用刮擦等物理方式取样，而刮擦等物理方法会因操作者的技术熟练程度有所不同，细胞会有一定的损害，通过Recell获取的细胞活力仅在70%左右，因此，表皮干细胞的实际获取量难以确认，同时，由于细胞是呈液态喷雾在受损皮肤表面，细胞发生流动，很难保证细胞在创伤面的均匀分布，由此烧伤创面的愈合也无法保证，需要多次喷雾才能最终实现烧伤创面的恢复，延长了治疗流程，且所用的整个喷雾套件目前仍以进口设备为主，单台的价格在1-2万之间，治疗成本相应的也大大提闻。有鉴于此，本专利技术人对怎么样充分利用有限皮源的问题进行深入研究，开发出一种，本案由此产生。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种培养效率高、操作便捷、皮源利用率高的。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下:，包括预处理、消化和配液，具体步骤为，(I)预处理:取表皮，制成若干块表皮片；(2)消化:取步骤(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；(3)配液:将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。为实现更好的使用效果，上述技术方案的进一步设置如下:步骤(1)中，所取的表皮为断层皮片，制得的每块表皮片的粒径在l_5mm。步骤(2)中，每l-2cm2断层皮片添加4_6ml的消化酶，所述的消化酶中主要作用成分为胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05% ;动态消化是在恒温条件下进行的，由交替进行的静置和动态两种状态组成，即先静置5-7分钟(也可称为静态消化)，然后进入动态，动态保持3-7分钟后，再静置5-7分钟后，进入动态，温度控制在35-380C，优选为36.8-37.5°C，静置-动态-静置-动态构成一个循环，每个动态消化过程包含2-5次该循环，动态消化完成后进行细胞冲刷。较优的，断层皮片的厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片；动态时确保消化容器内物质的转速为60-300rpm，优选转速为180-300rpm，细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。在步骤(3)与步骤(2)之间，至少进行一次过滤，采用目数为20-60条件下进行过滤，去除表皮残渣，而下层的细胞液用于配液。较优的，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂优选为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清的添加1-3滴(每15滴为1ml)，大豆胰蛋白酶添加量为下层细胞液量的0.8-3倍。步骤(3)中，蛋白凝胶优选为纤维蛋白胶，混合过程为:分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。较优的，促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，每5-10ml纤维蛋白胶中加入1-3滴(每15滴为Iml)促凝剂，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。上述技术方案中，所述的预处理、消化和配液等步骤是在表皮动态消化仪或生物培养用摇床上进行的，表皮细胞动态消化仪包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、传感器和电源，其中，控制面板包括显示屏和按键，振动器安装在消化容器的底部，使消化容器产生一定频率的振动；加热器安装在消化容器的外表面上，用于加热消化容器内的液体，温度传感器安装在消化容器上，用于监测消化容器的加热温度，上述加热器、振动器分别与控制单元的输出端相连，控制面板和传感器器分别与控制单元的输入端相连，电源分别为控制面板、控制单元、加热器和振动器供电。由于表皮细胞中除表皮干细胞外，其他细胞同样具有增殖的功能，有助于创面愈合，因此，本专利技术的上述方案中，将全部的断层皮片作为表皮细胞来源；整个动态消化过程是在35-38°C恒温条件下，采用生物摇床(实验过程中可选用常规的生物实验室培养用摇床，如型号为HS-100C的)、振动器(振动器作用与生物实验室培养用药创相同，结构不同，因而转速也存在差异，通常需要转换)等方式提供动态条件，一方面可获得更大、更多的细胞量，同时，消化酶的使用浓度和使用量也可以大大降低，消化过程在十几分钟内即可完成，与常规的过夜消化方式相比，缩短了消化时间，更有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，采用本专利技术中的动态消化技术获得表皮细胞是一种可靠的方法，配液所得的已经分化的表皮细胞喷涂在创面上，表皮细胞在创面通过逆分化形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。其中，断层皮片的定义是指皮肤的皮下组织以上的皮肤部分，包括刃厚皮片(厚度在0.3mm左右)和中厚皮片(厚度在0.3-0.6mm左右)。【附图说明】图1为本专利技术实施例2中所用表皮细胞富集仪的俯视结构示意图；图2为本专利技术实施例2中所用表皮细胞富集仪的立体结构示意图；图3为采用本专利技术所得细胞应用于裸鼠背部创面后第2周的染色结果对照(100倍显微镜下);图4为采用本专利技术所得细胞应用于裸鼠背部创面后第3周的染色结果对照(100倍显微镜下);图5为采用本专利技术所得细胞应用于裸鼠背部创面后第4周的染色结果对照(100倍显微镜下);图6为显微镜下静态消化获得的活的表皮细胞得到富集(100倍相差显微镜下)；图7为显微 镜下动态消化获得的成纤维细胞得到富集(100倍相差显微镜下)。图中标号:底座I ;底座上表面11 ;底座下表面12 ;操作台13 ;控制面板2 ;显不屏21 ;按键22 ;消化容器3 ;过滤容器4 ;导流管41 ;混合容器5 ;控制单元6 ;加热器7 ;振动器8 ;传感器9 ;电源10。【具体实施方式】实施例1[0031 ] 本实施例中，，包括预处理、消化和配液，具体步骤为，(I)预处理:取2cm2的断层皮片，其中，断层皮层为断层厚度为0.3mm的中厚表皮，将断层皮片制成直径为2-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
表皮细胞的动态富集方法，其特征在于，包括预处理、消化和配液，具体步骤为，（1）预处理：取表皮，制成若干块表皮片；（2）消化：取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；（3）配液：将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀。

【技术特征摘要】
1.表皮细胞的动态富集方法，其特征在于，包括预处理、消化和配液，具体步骤为， (1)预处理:取表皮，制成若干块表皮片； (2)消化:取步骤(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液； (3)配液:将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀。2.如权利要求1所述的表皮细胞的动态富集方法，其特征在于:步骤(1)中，所取的表皮为断层皮片，每块表皮片的粒径在l_5mm。3.如权利要求2所述的表皮细胞的富集及应用，其特征在于:所述的断层皮片的厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片。4.如权利要求1所述的表皮细胞的动态富集方法，其特征在于:步骤(2)中，每1-2cm2断层皮片添加4-6ml的消化酶，所述的消化酶中包括胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05% ;动态消化在恒温条件下进行，由交替进行的静置和动态两种状态组成，动态消化完成后进行细胞冲刷，获得细胞悬液。5.如权利要求4所述的表皮细胞的动态富集方法，其特征在于:交替进行的每对静置、动态构成一个循环，动态消化时，先静置5-7分钟，再进入动态，动态保持3-7分钟后，每个动态消化包括2-5个循环，温度恒定控制在35-38°C。6.如权利要求4或5所述的表皮细胞的动态富集方法，其特征在于:所述的动态时确保消化容器内物质的转速为60 -300rpm ;细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。7.如权利要求6所述的表皮细胞的动态富集方法，其特征在于:所述的动态时确保消化...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩春茂，胡信雷，鲁建国，韩阳，
申请(专利权)人：绍兴振德医用敷料有限公司，
类型：发明
国别省市：