一种表皮细胞抑裂素及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生化分离纯化技术领域，具体涉及一种表皮细胞抑裂素及其制备方法和应用。本发明专利技术用胶体磨替代高速组织捣碎机，将猪皮制成匀浆的方法，更适合工业化生产需要，并且蛋白质的得率提高70%以上。本发明专利技术将水抽提液经超滤浓缩后加乙醇分级沉淀比原工艺直接乙醇沉淀的方法乙醇的用量降低97%，降低了生产成本，在纯化过程中采用阳离子交换层析，大幅提高皮抑素的比活性。皮抑素可以有效地抑制表皮细胞的分裂，对银屑病人的症状有明显的缓解和止痒的作用，对皮肤癌也有一定的治疗价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化分离纯化
，具体涉及一种表皮细胞抑裂素及其制备方法和应用.
技术介绍
表皮细胞抑裂素(简称皮抑素)是动物的表皮细胞产生的一种内源性的蛋白质细胞因子，它可以作用于动物的表皮细胞，抑制表皮细胞的有丝分裂使之停留在细胞生长周期的Gl期。20世纪初就有人发现生物体内存在抑制细胞分裂的物质，以后有人发现一种组织的抽提液加到同种组织中能抑制该组织细胞的分裂。1960年Bulough和Laurence在研究体内上皮细胞分裂的控制中指出有一个内源性的细胞专一的抑制剂可以阻断细胞的生长周期，这种抑制剂是由细胞产生的一种内源性物质，在体内起负调控作用，因此提出 “Chalone”这一名词命名这一类物质,指它们在体内起减速或中断的作用。Chalone由于来源不同，靶细胞不同而有许多种，例如淋巴细胞抑裂素、表皮细胞抑裂素、粒细胞抑裂素、肝细胞抑裂素等。它们都有4方面的共性(1)有组织特异性(2)无种族特异性(3)无细胞毒性(4)可逆性。鉴于上述特异性，抑素对于一些异常的分裂、增殖应该可以起到抑制作用。显然具有潜在的应用前景，例如淋巴细胞抑裂素有可能发展为抗排异药、肝细胞抑裂素有抑制肝癌细胞快速生长的功能、表皮细胞抑裂素具有抑制某些类型银屑病病人皮屑大量生成的作用。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是对皮抑素的提取纯化，作较大改进使之更适合工业化生产，使工艺更合理、得率更高、质量更好、更稳定。活性使用HaCat人永生化表皮细胞株中位测定法，使操作更方便、科学、可靠性、可比性更强本专利技术的技术方案 本专利技术所述表皮细胞抑裂素由动物皮分离纯化，分子量为30000-50000。(I)、表皮细胞抑裂素的制备方法取新鲜猪皮削除所附脂肪组织，洗净，用绞肉机绞成肉皮糜，称量重量，加入三倍水用胶体磨将肉皮糜磨成匀浆，搅拌3小时、过滤，滤渣再加入二倍体积水再搅拌2小时，合并二次滤液。滤液脱脂肪，通过截止分子量10000的超滤膜过滤，浓缩至起始体积的3%-5%，将浓缩后超滤保留液用乙醇沉淀，取30% — 80%的沉淀部分用PH7. 5的磷酸缓冲液溶解，离心取上清。将上清液调至PH酸性此时皮抑素带正电荷，可以交换至SP— S印harose离子交换柱上，而大量杂蛋白可以穿过而被洗去，改用PH8. 0的磷酸缓冲液洗脱可得洗脱峰I，再改用含0. 5 M NaCl的PH8. 0磷酸缓冲液洗脱可得洗脱峰2 (层析结果见附图说明图1)，测活性证明活性主要在峰I中，峰2中亦有部分活性SP—Sepharose F. F是一种阳离子交换剂，皮抑素在酸性条件下带正电荷，可以交换在层析柱上，所有带负电荷的蛋白质不能交换在柱上，都在穿过峰中，被K16. 5的磷酸缓冲液洗脱；然后改用PH8. 0的磷酸缓冲液，因为PH8. 0高于皮抑素的等电点，皮抑素带负电荷，因此将大部分皮抑素洗下，再用含0.5M NaCl的磷酸缓冲液，由于离子强度增加，其他等电点高的蛋白也被洗脱。活性测定结果上柱前样品的比活性为2975u/mg，穿过峰面积很大但比活性很低，只有989u/mg，洗脱峰I面积很小但比活性很高，达到244285u/mg比上柱前提高82倍。洗脱峰2面积较小仍有少部分皮抑素，比活性为62160u/mg。(2)、皮抑素的活性测定采用HaCat人永生化表皮细胞株(购自上海复祥生物技术有限公司)细胞培养在RPMI1640培养液(含小牛血清10%)中，在37°C、C02培养箱中培养，待细胞长至铺满培养瓶壁的80%左右时用0. 25%胰蛋白酶将细胞消化，制成3X 104/ml。细胞悬液在96孔培养板中每孔加160ii I细胞悬液,培养20小时后加入皮抑素40ii I。稀释依溶液中皮抑素的含量而定，可以从每孔微克水平倍比稀释至纳克或者匹克水平，对照组加40 ill培养液。各种浓度做三孔重复，继续培养72小时后加入5mg/ml MTT 20iU，再培养4小时，倒去上清加入二甲亚砜IOOii I显色，在酶标仪0D492nm处读数，将三个重复孔的读数取平均值，与对照组的平均值计算抑制百分率，规定抑制1%为一个活性微单位(mu)。将抑制百分率对每孔的蛋白质浓度做图，可得一个S型曲线，得上下平台，取上下平台的中 值为活性点。活性点的蛋白量/孔含有的活性单位称为比活性(u/mg)，比活性代表皮抑素的纯度，比活性高表示皮抑素的活性亦高。比活性(u/mg) = (3)、皮抑素应用将除菌后皮抑素(比活性大于2000u/mg)加入软膏中，供银屑病病人外用，病人黄某(寻常型银屑病)为30多年的病人，全身性皮损，曾用多种治疗方法，只能短暂缓解，试用皮抑素治疗左腿三周，每日早晚两次外擦，右腿作为对照，三周后左腿皮屑全消，皮肤恢复弹性、光滑，仅留红色色素沉着印迹，亦不再搔痒，而未经治疗的右腿仍然覆盖着很厚的皮屑、坚硬、粗糙如故(结果见附图3)。在医生配合下，也曾给多位病人试用过皮抑素。在南京某医院四位病人中有三位住院病人治疗后疗效很好，一位非住院病人疗效不明显。在天津某医院治疗10位病人，疗效显著，医生反馈比进口含激素的药效更好。南京二位斑块型银屑病病人用药后疗效也十分显著。皮抑素不但对人永生化表皮细胞有抑制分裂的作用，对A431皮肤癌细胞也有明显的抑制作用，以一个部分纯化制品比活500u/mg的皮抑素试验，每孔450ng的水平，A431细胞的生长被抑制40%。A431皮肤癌细胞I X 104/ml, 96孔板中每孔加160 ill细胞悬液，在C02培养箱37°C培养20小时，加皮抑素40 yl，皮抑素浓度从625ng/ml起倍比稀释至19. 8ng。培养72小时后用MTT法显色，0D492nm读数，与对照组读数计算抑制百分率，对每孔中蛋白质量作图，可见皮抑素对A431皮肤癌细胞有很强的抑制作用，说明皮抑素可用于治疗皮肤癌。结果见附图4。本专利技术生产的皮抑素可制备成治疗银屑病或皮肤癌的药物。本专利技术与现有技术相比其有益效果是 (I)、现工艺将猪皮去脂肪，切成Icm2小块，加水用高速组织捣碎机匀浆，过滤，滤渣再匀浆一次，合并滤液。本专利技术改用胶体磨，猪皮被完全磨成匀浆，蛋白质提取率提高70%以上，更适合工业化生产。(2)、现工艺水抽提液直接加乙醇，30% — 85%沉淀，溶解蛋白质得率为I. 09g/kg猪皮，每公斤猪皮需43L乙醇。本专利技术将水抽提液先超滤，将分子量小于I万的无活性蛋白质去除，同时浓缩了抽提液体积至3% — 5%，再用30% — 70%乙醇沉淀，节省了乙醇97%以上，蛋白质得率为3. 28g/kg猪皮，得率提高3倍、比活性提高6倍、总活性提高了 300倍，由于在纯化过程中去除了猪皮中原来存在的表皮细胞生长因子类的物质，故而总活性远超过起始水抽提液中的总活性，降低了生产成本、节约了人力、还节省了大量因使用易燃物品而必须增加的保护设施如乙醇的运输、回收、危险品仓库等各种必要的设备和监管人员的费用。比较结果见下表格本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表皮细胞抑裂素,其特征是从动物皮中分离纯化，分子量为30000?50000。

【技术特征摘要】
1.一种表皮细胞抑裂素，其特征是从动物皮中分离纯化，分子量为30000-50000。2.权利要求I所述一种表皮细胞抑裂素的制备方法，其特征是由以下步骤构成 (1)、以新鲜洗净的去油脂猪皮作为原料，通过绞肉机将猪皮制成肉皮糜； (2)、以猪皮重量三倍的水作为提取液，加入肉皮糜中，通过胶体磨研磨成匀浆，在10°C以下搅拌2-3小时、过滤，滤渣再加入二倍体积水再搅拌2小时，合并二次滤液，4°C静置过夜去除上层油脂； (3)、去油脂滤液通过截止分子量10000的超滤膜过滤，浓缩至起始体积的3%; (4)、将分子量大于10000的超滤保留液经30-80%乙醇沉淀，再溶解； (5)、将上清液通过SP—S^harose F. F阳离子交换层析柱，皮抑素交换在层析柱上，改...

【专利技术属性】
技术研发人员：金以丰，吴奇，马晓艳，张太平，宣勤贵，
申请(专利权)人：南京必优康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：