一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法技术

本发明专利技术公开了一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法；无血清培养猪睾丸细胞的方法为：将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代；重复上述步骤，逐步将血清含量从10%减至5%、2%、1%直到无血清培养；最后利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。本发明专利技术无血清驯化培养得到猪睾丸细胞，该细胞可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，不仅避免了动物血清的使用带来的风险，同时使培养基成分明确、提高了批次间同一性、简化了下游纯化加工过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于疫苗制备
，涉及。
技术介绍
猪瘟(classical swine fever, CSF)，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病。1984年世界动物卫生组织(OIE)将其列入A类传染病，我国目前也将其定为一类传染病。猪瘟除可引起败血症以外，还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗、淋巴细胞和血小板减少等。目前，世界大部分国家都采取了严格的卫生防疫措施和剔除猪瘟感染猪净化猪群来控制和消灭猪瘟，一些发达国家通过防疫和防控手段已经彻底根除了猪瘟。所以，免疫接种是猪瘟防控的重要措施，而且对无猪瘟国家爆发猪瘟时根除本病和阻止野毒传向无猪瘟猪群也很有必要。因此，各国学者一直没有放弃对猪瘟疫苗的研制和开发。 至今为止，猪瘟疫苗在研发及临床应用上主要有猪瘟灭活苗、猪瘟弱毒苗、猪瘟基因工程疫苗、猪瘟标记疫苗、以及猪瘟DNA疫苗等几类。其中猪瘟灭活苗是在上世纪中页由Dorest等首先利用结晶紫制备的，但由于其低免疫原性、低保护力等因素已退出市场。猪瘟弱毒苗主要有兔弱化苗及低温细胞苗，两种疫苗都是由弱毒制备，是目前市场上主要应用的产品。猪痕基因工程苗主要有由Hulst、Bouma、及Tsibezov等分别制备的亚单位疫苗；以及由Dong等制备的多肽疫；还包括Rumenapf、Konig、Peeter等分别制备的活病毒载体疫苗，但都由于免疫源性或安全性等因素没有取得良好的实用效果，甚至没有上市应用。猪瘟标记疫苗的本质仍是亚单位疫苗，是在研发时去掉保护性抗原的某一表位，在临床应用后，可根据动物体所产生的特异性抗体种类而区分动物是自然感染还是经过免疫。标记疫苗从上世纪末期至今都有报道，虽然有着较好的安全性及临床应用的便捷，但由于免疫源性等原因，目前还没有较好的产品问世。而DNA疫苗作为疫苗研发领域内的一个重要部分，每年都有针对各种病原体的DNA疫苗的报道，但是由于DNA疫苗涉及转基因问题，在全世界对转基因问题的看法不会改变时，DNA疫苗仍无法实际应用。综上所述，目前市场上所应用的猪瘟疫苗仍旧以兔弱化苗及由细胞培养而来的细胞苗为主。其中我国主要应用的兔弱化苗是1954年成功培育出并制成疫苗的CLS株病毒，也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织，该毒株虽然可以通过怀孕猪的胎盘屏障，但不感染胎儿引起任何畸变，同时毒力不返强，对乳猪和种猪无残余毒性。而细胞苗主要应用毒株有GPE株及Thiverval株，此弱毒株都是由强毒株在猪睾丸或猪肾细胞上通过传代，随后用终点稀释法选出纯系毒株，再通过牛睾丸细胞及豚鼠肾细胞传代，最终筛选出纯系毒株，该毒株能很好的在30°C温度中增殖。在生产及应用上与兔弱化苗相比，细胞苗是用细胞培养，都是以种子批系统为基础，每批种子在同一性、无菌性、纯度、安全性、非传染性、稳定性和免疫原性等方面都是一致的，以确保同批疫苗的均一性。但在疫苗生产过程中动物血清的使用会产生成本增加、引入外源蛋白、引入其他病毒及病原体的风险，是细胞苗在生产过程种面临的一个棘手问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供，无血清驯化培养得到的猪睾丸细胞，可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，并且避免动物血清的使用带来的风险。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案: 本专利技术公开了一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，包括以下步骤: 1)将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 2)当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 3)当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 4)当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含1%小牛血清的培养基传 代培养3-5代； 5)当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3-5代； 6)利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。进一步，所述步骤6)中，利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系的具体步骤为: ①将细胞传入96孔细胞培养板中培养； ②当细胞贴壁后，留下只含有一个细胞的孔，抛弃其他孔； ③持续培养直至单细胞生长成集落并布满60%孔底，消化细胞并按对应位置将一半细胞传入另一 96孔板中； ④继续培养，将其中一个96孔板进行扩大培养并保存细胞，另一个96孔板待细胞长满后接入猪瘟病毒，37 C吸附Ih后更换新鲜培养基继续培养； ⑤在接毒后24h、36h、72h分别通过ELISA方法检测病毒滴度，筛选出具有较好产毒能力的细胞系。进一步，所述培养基为MEM培养基、DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基或1640培养基。进一步，所述培养基中加入2_10(^g/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素。进一步，所述培养基中加入lOPg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为肝素。进一步，所述培养基中加入1%_10%的外源蛋白质，所述蛋白质为牛血清白蛋白和胰蛋白胨。进一步，所述培养基中加入1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。本专利技术还公开了一种利用无血清培养的猪睾丸细胞生产猪瘟细胞疫苗的方法，将猪瘟病毒接种于无血清培养的猪睾丸细胞并按常规培养条件培养。进一步，所述猪瘟病毒为CLS株、GPE株或Thiverval株。本专利技术的有益效果在于:本专利技术无血清驯化培养得到猪睾丸细胞，该细胞可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产,不仅避免了动物血清的使用带来的风险，同时使培养基成分明确、提高了批次间同一性、简化了下游纯化加工过程。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1:无血清培养猪睾丸细胞 1)将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 2)当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 3)当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基`传代培养3-5代； 4)当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3?5代；?2）当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3?5代；?3）当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基传代培养3?5代；?4）当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含1%小牛血清的培养基传代培养3?5代；5）当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3?5代；6）利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 2)当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 3)当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 4)当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含1%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 5)当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3-5代； 6)利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。2.根据权利要求1所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于:所述步骤6)中，利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系的具体步骤为: ①将细胞传入96孔 细胞培养板中培养； ②当细胞贴壁后，留下只含有一个细胞的孔，抛弃其他孔； ③持续培养直至单细胞生长成集落并布满60%孔底，消化细胞并按对应位置将...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳春，曹政，岳秀阳，李春燕，
申请(专利权)人：重庆澳龙生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：