本发明专利技术公开了一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法。以羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素作为能量转移的给体，纳米金作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素将能量传递给纳米金，使其荧光发生猝灭。而免疫球蛋白G加入后却使异硫菁酸荧光素的荧光恢复，且其荧光恢复值与免疫球蛋白G的浓度在4.0~220.0纳克/毫升范围内呈良好的线性关系，从而建立检测人免疫球蛋白G的新方法。本发明专利技术克服了已有技术在检测时存在灵敏度低、操作繁琐等缺点，对于人血清中免疫球蛋白G的检测更加方便快速。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法。以羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素作为能量转移的给体，纳米金作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素将能量传递给纳米金，使其荧光发生猝灭。而免疫球蛋白G加入后却使异硫菁酸荧光素的荧光恢复，且其荧光恢复值与免疫球蛋白G的浓度在4.0~220.0纳克/毫升范围内呈良好的线性关系，从而建立检测人免疫球蛋白G的新方法。本专利技术克服了已有技术在检测时存在灵敏度低、操作繁琐等缺点，对于人血清中免疫球蛋白G的检测更加方便快速。【专利说明】一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法
本专利技术涉及一种利用异硫菁酸荧光素与纳米金能量转移技术速检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法。
技术介绍
免疫球蛋白G是血清中含量最高的一种免疫蛋白，约占血清免疫蛋白的70%~80%，是机体再次免疫应答后形成抗体的主要组分，在机体防御机制中发挥着重要的作用，在临床上作为多种疾病诊断及疗效评价的重要指标，因此其定性、定量检测十分重要。目前，国内外检测人免疫球蛋白G的主要方法有酶联免疫法，电压免疫传感技术，电化学发光免疫技术，荧光传感技术，紫外吸收光度法等。以上方法有的操作复杂，有的灵敏度不高。因此，寻求一种快速、准确、高选择性的方法检测人血清中免疫球蛋白G具有重要的意义。能量转移技术是一种新型荧光检测技术，具有灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射法相比受瑞利散射光干扰小等特点。同时，本文利用免疫球蛋白G与纳米金对羊抗人免疫球蛋白G标记的异硫菁酸荧光素的竞争作用，只需要标记荧光给体，而省却了标记受体的操作，节省了药品。本方法利用其独特的检测特性，从而建立快速、灵敏、准确的检测免疫球蛋白G的新方法。目前国内外应用异硫菁酸荧光素与纳米金能量转移法在免疫球蛋白G的检测上尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种方法简单，灵敏度高，选择性好，方便快速的检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度 的方法。本专利技术的思路:以羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素作为能量转移的给体，纳米金作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素将能量传递给纳米金，使其荧光发生猝灭。而免疫球蛋白G加入后却使异硫菁酸荧光素的荧光恢复，且其荧光恢复值与免疫球蛋白G的浓度在4.0~220.0纳克/毫升范围内呈良好的线性关系，从而建立检测人免疫球蛋白G的新方法。本专利技术的具体机理:羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素与纳米金发生能量转移使其自身的荧光发生猝灭。能量转移速率与给体，受体间的距离有关，免疫球蛋白G的加入可与异硫菁酸荧光素上的羊抗人免疫球蛋白G抗体发生抗原抗体特异性免疫反应，使得纳米金与异硫菁酸荧光素之间的距离更远，能量转移现象受到抑制，使得羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素的荧光有规律恢复。具体步骤为: (I)纳米金溶液的制备: 将5毫升5毫摩尔/升氯金酸加入到100毫升亚沸水中，在不断搅拌下加热至沸，然后快速加入5毫升质量体积浓度为0.1%的柠檬酸溶液，保持沸腾10分钟，溶液的颜色逐渐变成酒红色，停止加热，在10000转/分钟转速下离心10分钟，除去过量的柠檬酸，即制得浓度为50纳摩尔/升的纳米金溶液，在4°C的条件下保存，备用。(2)羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液的制备: 将20毫升1.0X 10_5摩尔/升异硫菁酸荧光素，100微升20毫克/毫升的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和100微升10毫克/毫升的N-羟基丁二酰亚胺在室温下混合搅拌0.5小时，再加入100微升I毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗体，在室温下孵化2小时，最后在10000转/分钟的转速下离心30分钟，除去多余的抗体，即制得羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，在4 °C的条件下保存，备用。(3)配制溶液: 分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800 微升步骤(1)制备的纳米金溶液和 0、2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升1.0X 10_5克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中，用pH = 7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；所述pH = 7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠。(4)工作曲线的绘制: 将步骤(3)制得的溶液分别用RF-5301 PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米；根据测量结果，免疫球蛋白G的浓度c在4.0^220纳克/毫升范围内与荧光恢复值AIf呈良好的线性关系，其线性回归方程为:AIf= 9.52+1.68c，线性相关系数 r = 0.9987。(5)人血清中免疫球蛋白G的检测: a.将待测人血清样品用50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液稀释1000倍作为待测溶液。b.分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800微升步骤(1)制备的纳米金溶液和步骤(5)第a步制备的待测溶液加入5毫升色管中，用PH = 7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；用RF-5301 PC荧光光度计在激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米的条件下进行荧光强度检测，测得荧光恢复量AIf，根据步骤(4)所得的线性回归方程，即算出免疫球蛋白G的浓度c ;所述pH =7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠。本专利技术方法克服了已有技术在检测时存在反应时间长、操作繁琐、灵敏度低、等缺点，更好地提高了灵敏度和选择性，对于人血清中免疫球蛋白G的检测更加准确方便快速。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术中不同浓度的免疫球蛋白G对异硫菁酸荧光素的荧光恢复谱图。图中a 到 j 分别为 0,2.0,5.0,10.0,20.0,30.0,50.0,70.0,110.0 微升 1.0Χ10-5克/毫升的免疫球蛋白G在5毫升比色管中定容至刻度后对异硫菁酸荧光素的荧光恢复光谱图。图2为本专利技术中免疫球蛋白G的浓度c与异硫菁酸荧光素-纳米金能量转移体系中异硫菁酸荧光素的荧光恢复量的关系图。【具体实施方式】实施例:(I)纳米金溶液的制备: 将5毫升5毫摩尔/升氯金酸加入到100毫升亚沸水中，在不断搅拌下加热至沸，然后快速加入5毫升质量体积浓度为0.1%的柠檬酸溶液，保持沸腾10分钟，溶液的颜色逐渐变成酒红色，停止加热，在10000转/分钟转速下离心10分钟，除去过量的柠檬酸，即制得浓度为50纳摩尔/升的纳米金溶液，在4°C的条件下保存，备用。(2)羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液的制备: 将20毫升1.0X 10_5摩尔/升异硫菁酸荧光素，100微升20毫克/毫升的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和100微升10毫克/毫升的N-羟基丁二酰亚胺在室温下混合搅拌0.5小时，再加入100微升I毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗体，在室温下孵化2小时，最后在10000转/分钟的转速下离心30分钟，除去多余的抗体，即制得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法，其特征在于具体步骤为：(1)纳米金溶液的制备：将5毫升5毫摩尔/升氯金酸加入到100毫升亚沸水中，在不断搅拌下加热至沸，然后快速加入5毫升质量体积浓度为0.1%的柠檬酸溶液，保持沸腾10分钟，溶液的颜色逐渐变成酒红色，停止加热，在10000 转/分钟转速下离心10 分钟，除去过量的柠檬酸，即制得浓度为50纳摩尔/升的纳米金溶液，在4℃的条件下保存，备用；(2)羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液的制备：将20毫升1.0×10‑5摩尔/升异硫菁酸荧光素，100微升20毫克/毫升的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和100微升10毫克/毫升的N‑羟基丁二酰亚胺在室温下混合搅拌0.5小时，再加入100微升1毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗体，在室温下孵化2小时，最后在10000转/分钟的转速下离心30分钟，除去多余的抗体，即制得羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，在4 ℃的条件下保存，备用；(3)配制溶液：分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800微升步骤(1)制备的纳米金溶液和0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、70.0、110.0微升1.0×10‑5 克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中，用pH＝7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；所述pH＝7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠；(4)工作曲线的绘制：将步骤(3)制得的溶液分别用RF‑5301 PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米；根据测量结果，免疫球蛋白G的浓度c在4.0~220 纳克/毫升范围内与荧光恢复值ΔIF呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔIF= 9.52+1.68c，线性相关系数r = 0.9987；(5)人血清中免疫球蛋白G的检测：a.将待测人血清样品用50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液稀释1000倍作为待测溶液；b.分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800微升步骤(1)制备的纳米金溶液和步骤(5)第a步制备的待测溶液加入5毫升色管中，用pH＝7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；用RF‑5301 PC荧光光度计在激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米的条件下进行荧光强度检测， 测得荧光恢复量ΔIF，根据步骤(4)所得的线性回归方程，即算出免疫球蛋白G的浓度c；所述pH＝7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陶慧林，廖秀芬，徐铭泽，谢襄漓，钟福新，易忠胜，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。