本发明专利技术提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒是以纯化的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为包被抗原的ELISA板条。RT-PCR方法扩增获得猪流行性腹泻病毒N基因，定向插入pET-28a载体构建pET-28a-N重组质粒，转化BL21（DE3）感受态细胞，获得原核表达菌pET-28a-N/BL21。经IPTG诱导表达、纯化，获得重组N蛋白。本发明专利技术试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，属于生物
。该试剂盒是以纯化的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为包被抗原的ELISA板条。RT-PCR方法扩增获得猪流行性腹泻病毒N基因，定向插入pET-28a载体构建pET-28a-N重组质粒，转化BL21（DE3）感受态细胞，获得原核表达菌pET-28a-N/BL21。经IPTG诱导表达、纯化，获得重组N蛋白。本专利技术试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。【专利说明】检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒
本专利技术涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用，属于生物
。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一种急性、高度接触性的传染病,常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒是此次疫情的元凶。此后该病在我国猪群中广泛流行。目前对于PEDV的诊断主要是依靠RT-PCR方法，该方法对实验设备和条件要求较高，不适合临床上的大规模快速诊断。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要措施之一。ELISA法具有简便、快速、特异性强等优点，而且ELISA检测抗体能够评价疫苗的免疫效果，但需要抗原纯度较高且免疫原性良好。PEDV N蛋白是由441个氨基酸组成、分子质量为55?58 ku、磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥着重要的作用，它能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒的组装和RNA复制体的形成。并且N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占的比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达。猪在感染PEDV的早期体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体。冠状病毒N蛋白又十分保守，所以利用N蛋白来建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。
技术实现思路
技术问题 本专利技术基于上述猪流行性腹泻病毒的特点与研究结果，提供了一种检测PEDV抗体的ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒成本低廉、操作简便，为PEDV的检测提供了一种快捷易用的血清学诊断方法，市场前景良好。技术方案 本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的: 本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤: (O以猪流行性腹泻病毒RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因(登录号KC210145)，扩增片段大小为1326 bp，并以pET_28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N。N基因与pET_28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N,双酶切鉴定重组质粒。(2)将阳性重组表达质粒pET-28a_N转化BL21 (DE3)感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21。该单克隆于37°C培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定。取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定。根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定。大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用N1-TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤N1-TED柱所得洗涤液、IxElutionBuffer洗脱所得纯化蛋白。所述PEDV重组N蛋白用于制备检测猪流行性腹泻病抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分: (I)ELISA板条:以所述猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5% (Μ/V)脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4°C保存。(2)洗涤液:含0.05%吐温-20的ρΗ7.4磷酸盐缓冲液(PBS-T)； (3)血清稀释液:5%(Μ/V)脱脂乳； (4)底物显色液:已加入H2O2的TMB溶液； (5)羊抗猪酶标二抗:已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗； (6)终止液:2MH2SO4溶液; (7)PEDV阳性血清 (8)PEDV阴性血清 所述ELISA试剂盒在检测猪流行性腹泻病时，主要操作步骤如下: (1)加入血清样品: 用血清稀释液5% (Μ/V)脱脂乳将待检血清做1:50稀释后，每孔加入100 μ L,每一血清样品添加两孔，同时设立PEDV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用60分钟，弃去反应孔中的液体:每个孔用200 μ L洗涤液充分清洗3次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体； (2)加入羊抗猪酶标二抗: 每孔加入100 μ L羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，如步骤(1)中方法洗涤； (3)加入底物显色液: 每孔加入100 μ L已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用15分钟； (4)终止反应: 每孔加入100 μ L 2Μ H2SO4终止液，终止显色反应； (5)用酶标仪测定OD值: 使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值； (6)结果判定: 计算各份血清OD45tl与标准阳性血清OD45tl的比值S/P，当样品S/P值≥0.26时为阳性，< 0.26时为阴性。有益效果 本专利技术ELISA试剂盒，使用猪流行性腹泻病病毒(PEDV)重组N蛋白作为包被抗原，该蛋白为PEDV N基因重组pET-28a-N表达载体的原核表达产物，易于制备与纯化，免疫反应性良好。该蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定与控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制。本专利技术试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。【专利附图】【附图说明】图1 pET-28a-N/BL21 表达菌阳性单克隆鉴定。M:DS 10000 Marker ;1:阴性pET-28a-N/BL21 菌单克隆；2:阳性 pET_28a_N/BL21 菌单克隆；3:阳性 pET_28a_N/BL21 菌单克隆。图 2 PEDV N 蛋白的诱导表达。M:Prestained Peotein Ruler ;P:诱导后 pET_28a空载体菌； O:未诱导pET-28a-N/BL21菌；1:诱导后Ih pET-28a_N/BL21菌液样品；2:诱导后2h pET-28a-N/BL21菌液样品；3:诱导后3h pET-28a本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤：（1）以猪流行性腹泻病毒PEDV的RNA作为材料，通过RT‑PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号KC210145，扩增片段大小为1326bp，并以pET‑28a质粒作为载体构建重组质粒pET‑28a‑N，N基因与pET‑28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET‑28a‑N，双酶切鉴定重组质粒；将阳性重组表达质粒pET‑28a‑N转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET‑28a‑N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS‑PAGE鉴定，取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS‑PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni‑TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤Ni‑TED柱所得洗涤液、1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，孙冰，何孔旺，杜露平，郭容利，倪艳秀，温立斌，俞正玉，张雪寒，茅爱华，吕立新，胡屹屹，周俊明，王小敏，祝昊丹，于洋，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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