一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。将序列如SEQ ID NO.1所示的基因整合到表达载体上并转入宿主菌；诱导宿主菌表达并纯化后获得序列如SEQ ID NO.2所示的PmA153重组抗原蛋白；将PmA153包被在固相载体上，即可通过酶联免疫吸附的检测方法实现对样品中的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的抗体的检测，实现诊断目的。本发明专利技术提供的试剂盒，不使用多杀性巴氏杆菌作为抗原来源，具有良好的生物安全性及生产便宜性，对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型抗体检测具有良好的特异性，能够精准诊断牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎，具有重要的临床应用价值。有重要的临床应用价值。有重要的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病原菌检测
，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella Multocida，Pm)荚膜B型是引起我国牛出血性败血症的病原菌。牛出血性败血症是以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血为特征的传染病，在我国已有几十年的流行历史，目前仍在多地呈散发或地方性流行。2008年，我国牛场出现了以纤维素性肺炎为典型症状的牛呼吸道传染病，并在黑龙江、甘肃、贵州、重庆、四川等数个省市流行。该病的临床表现以精神萎靡、食欲减退、咳嗽、流涕、体温升高和消瘦为特征。主要病理解剖变化在肺组织，呈广泛淤血和散在大小不一的脓肿结节，急性、亚急性或慢性的化脓性纤维素渗出与坏死，以及小叶间隔的水肿与化脓，严重者出现心包膜与胸膜粘连、纤维素性或化脓性胸膜炎。经哈尔滨兽医研究所等单位对数省市病料中的病原菌进行分离鉴定，并进行动物回归试验，确定了其病原菌为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型。
[0003]牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型与B型有显著的不同，例如A型菌生长在牛的肺部，在病牛的血液中几乎无法检测出A型菌，因此无法使用PCR方法对采样的血清进行病原检测，ELISA抗体检测是首选的方法。可是由于牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的许多基因与B型有高度同源性，抗原有交叉反应，因此很难找到一个特异性的蛋白抗原进行ELISA检测。传统的包被抗原使用A型特异性的荚膜抗原，但荚膜抗原无法使用大肠杆菌等基因工程菌进行大量表达，需要用病原菌培养提取，不但产量低，还容易造成生物安全问题。且多糖的定量和包被都比使用基因工程表达蛋白困难得多。因此使用基因工程表达蛋白，比荚膜抗原更容易制备和生产ELISA抗体检测试剂盒。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，以解决现有技术中缺少针对于牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的且可以大量制备的特异性抗原的技术问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，包括PmA153包被的固相载体；PmA153的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本方案还提供了一种抗原蛋白在制备特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的试剂盒中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本方案还提供了一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，包括PmA153包被的固相载体的制备步骤：
[0009]S1抗原蛋白的获取：将序列如SEQ ID NO.1所示的基因整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得PmA153。
[0010]S2包被：配制含PmA153的包被液，使包被液于固相载体接触并孵育，再经封闭处理后，获得PmA153包被的固相载体。
[0011]本技术方案的原理以及优点在于：
[0012]专利技术人通过对VISTA、NCBI等大量数据库筛选以及结合试验分析，获到一个特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型抗体的PmA153重组蛋白，构建了pET30a
‑
PmA153质粒。并在大肠杆菌中成功表达PmA153重组蛋白，使用镍柱进行纯化，获得了较高的蛋白纯度。针对PmA153蛋白进行检测，可以特异性地检测出牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型，可根据检测结果采用更有针对性的治疗手段。利用PmA153抗原蛋白，可以建立一系列基于免疫反应的、用于特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌株的检测方法以及检测试剂盒，包括但不限于各种类型的ELISA和免疫层析等。例如，基于PmA153抗原蛋白，还可以使用胶体金方法测定抗体、乳胶凝集法测定抗体，以及通过对流电泳法和琼脂扩散法测定抗体，这些方法只是具体实施方式不同，但都是以PmA153抗原蛋白为基础进行。
[0013]作为示例，专利技术人利用PmA153重组蛋白建立了牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒。试剂盒显示出了理想的检测特异性、稳定性和灵敏性。专利技术人进一步将本方案建立的试剂盒应用于临床检测中，取得了良好的效果。
[0014]进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒还包括标准阳性对照血清和标准阴性对照血清；所述标准阳性对照血清是由使用牛源多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌株免疫牛获得；所述标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜A型的牛血清。
[0015]进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒还包括酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。
[0016]进一步，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG；所述显色液为双组分TMB显色液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为PBST洗涤液；所述样品稀释液为含牛血清白蛋白、吐温
‑
20、EDTA和氯化钠的PBS液。
[0017]进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其判定标准为：待检样品的S/P值≥0.161时，判为阳性；待检样品的S/P值＜0.161时，判为阴性；S/P值的计算方法为：(样品OD
450
值－标准阴性对照血清OD
450
均值)/(标准阳性对照血清OD
450
均值－标准阴性对照血清OD
450
均值)；OD
450
是指在450nm波长下光密度；且标准阳性对照血清OD
450
值均≥2.0，标准阴性对照血清OD
450
值均＜0.25。
[0018]进一步，在S1抗原蛋白的获取中，表达载体为pET30a；诱导宿主菌表达抗原蛋白的试剂为异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷；宿主菌为Rosseta DE3；纯化的方式为通过Ni
‑
NTA Superflow Cartridges His亲和层析柱纯化。
[0019]进一步，在S2包被中，包被液中PmA153的含量为10μg/mL，孵育条件为4℃8
‑
12h；封闭处理为使用无蛋白封闭缓冲液37℃封闭2h。
[0020]进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，还包括标准阳性对照血清的制备步骤：使用牛源多杀性巴氏杆菌A型菌株的灭活疫苗免疫健康
牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清获得标准阳性对照血清。
[0021]综上所述，本技术方案的有益效果在于：
[0022]1)本专利技术提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒制备及应用方法，包被抗原为大肠杆菌基因工程表达Pm153重组蛋白抗原，不使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括PmA153包被的固相载体；PmA153的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照血清和标准阴性对照血清；所述标准阳性对照血清是由使用牛源多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌株免疫牛获得；所述标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜A型的牛血清。3.根据权利要求2所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。4.根据权利要求3所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG；所述显色液为双组分TMB显色液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为PBST洗涤液；所述样品稀释液为含牛血清白蛋白、吐温
‑
20、EDTA和氯化钠的PBS液。5.根据权利要求4所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，其判定标准为：待检样品的S/P值≥0.161时，判为阳性；待检样品的S/P值＜0.161时，判为阴性；S/P值的计算方法为：(样品OD
450
值－标准阴性对照血清OD
450
均值)/(标准阳性对照血清OD
450
均值－标准阴性对照血清OD
450
均值)；OD
450
是指在450nm波长下光密度；且标准阳性对照血清OD
450
值均≥2.0，标准阴性对照血清OD
450
值均＜...

【专利技术属性】
技术研发人员：高洋，赖茂林，杨元礼，冉智光，赵扬扬，秦世荣，杨婕，伏刚，赵宗玲，吕逢波，王为民，李朝阳，
申请(专利权)人：重庆澳龙生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：