一种无载体细胞片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于组织工程领域，特别涉及一种无载体细胞片及其制备方法与应用。该种无载体细胞片的制备方法包含如下步骤：把自杀基因转染到支持细胞中；在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；把目的细胞种植于支持细胞之上；在目的细胞之间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。本发明专利技术可获得具有良好生物学特性的无载体细胞片，是组织工程领域构建无载体细胞片上的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明专利技术原理科学可靠，工艺制作简单灵活。

【技术实现步骤摘要】
一种无载体细胞片及其制备方法与应用
本专利技术属于组织工程领域，特别涉及一种无载体细胞片及其制备方法与应用。
技术介绍
相对于包含支架材料(胶原凝胶、纤维蛋白凝胶或生物膜)的细胞片产品来说，无载体细胞片的构建和使用，具备的优势在于:①能够高效率地收集完整、连续的高密度细胞片，均匀建立二维和三维结构的组织或器官无载体细胞片基底部与细胞外基质具有好的黏附性，易于移植至体外其他培养容器中或体内组织表面，在移植时不用缝合，可直接黏附于受创伤的组织上；③由于无需使用支架材料，可避免体内移植后由于支架降解所诱发的炎症反应和组织纤维化等副作用。④具有灵活方便的可加工性，通过细胞片的堆叠和重建成更厚更复杂的组织结构，从而获得适用于各种组织病变的修复再生。目前，无载体细胞片已在动物实验、临床前研究以及临床应用等不同研究条件下取得了成功，为临床修复缺损组织提供了极具前景的治疗途径。现行的组织工程构建方案中，无载体细胞片的构建方法包括:①温敏培养皿法；②胶原凝胶法磁力法聚合电解质法粗糙颗粒法。不同的无载体细胞片构建方法直接影响细胞片的结构和生物学特性，最终影响移植后宿主对细胞片反应。其中:①温敏培养皿法指的是使用温敏材料作为细胞培养皿，通过改变温度使培养皿实现固液转换，从而使细胞片与培养皿分离，此方法的优点在于控制简单条件而实现细胞片与培养容器的分离，此方法的缺点在于细胞片可能会存在有机物质的残留，而且把细胞片从培养皿中取下的操作难度大。②凝胶法是通过把细胞种植在凝胶上，然后先用镊子把凝胶从培养容器中撕取下，再用蛋白酶把凝胶消化从而获取细胞片，此方法操作简单，但缺点在于合成凝胶过程复杂，而且在蛋白酶消化过程会对细胞造成损伤。③磁力法是通过制备具有磁性的阳离子脂质体MCLS，把MCLS与RGD结合成胶体涂料，在培养孔底部涂上此涂料，并在培养孔底部放置磁铁，把细胞种植在培养孔中，待细胞融合后移去磁铁，融合的细胞开始从外周逐渐与培养板脱离形成细胞片，此方法优点在于移植简便，可减少移植过程的机械损伤，但存在的缺点是此方法收获的细胞片残留有磁性物质，对宿主的毒性影响未知。④聚合电解质法通过形成聚合电解质薄膜，待细胞在薄膜上融合后，通过施加电压的方法使薄膜溶解，从而获取细胞片，此方法操作简便，使细胞保留了较好的机械性能和黏附性；不足之处是聚合电解质薄膜对目的细胞的生物学活性不能提供帮助和支持。⑤粗糙颗粒法是通过使用粗糙颗粒形成粗糙的单分子层，待细胞在单分子层上融合后通过吹打使细胞片自行脱落，此方法无需酶解消化作用，减低了对细胞的损伤，同时能获得较均匀的细胞片，然而此方法中使用的粗糙颗粒制法复杂，不易于操作。以上技术的共同特点在于:借助各种因素实现培养细胞片与培养容器的分离，从而获取完整的细胞片产品，操作过程中并未涉及维持目的细胞生物学活性的方案和步骤。目前这类方法制备的细胞片产品多为一些稳定的终末分化细胞，包括角膜上皮细胞，内皮细胞，心肌细胞等。虽然这些终末分化细胞的体外增殖能力以及旁分泌功能有限，但借助这些方法，可实现制备细胞片的目的，满足一定的临床应用需求。随着细胞片产品应用实践的深入开展，临床上对该类产品治疗效果提出了更高要求。众所周知，在临床应用中，治疗价值更高的目的细胞通常来源于一些低分化细胞，例如胚胎干细胞，诱导性多潜能分化细胞，骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞，羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心肌祖细胞等。这些细胞对于体外培养条件要求较高，通常需要一定的支持细胞(成纤维细胞、间质细胞，胶质细胞或其它种类干细胞)作为饲养层，借助支持细胞复杂的生理旁分泌作用来维持它们的低分化特点和相应生理功能。对于这类培养要求更高的低分化细胞来说，现行的各类方法，虽然也可制备出3~5层的细胞片产品，但由于这些低分化细胞脱离了体内生理微环境，并且缺乏相应支持细胞旁分泌作用的支持，低分化的目的细胞往往会快速分化，由细胞的低分化状态转变为终末分化状态，目的细胞原有的生物学特性很难维持，降低了细胞片产品的理论治疗效果。因此，如何在实现细胞片分离的同时进一步保障细胞的生物学特性和功能，是制约细胞片产品(尤其是干细胞来源的细胞片)应用的一个关键问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种无载体细胞片的制备方法，该方法可实现细胞片分离的同时进一步保障细胞的生物学特性和功能。本专利技术的另一目的在于提供由上述制备方法得到的无载体细胞片。本专利技术的再一目的在于提供上述无载体细胞片在组织工程领域中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种无载体细胞片的制备方法，包含如下步骤:(I)把自杀基因转染到支持细胞中；(2)在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；(3)把目的细胞种植于支持细胞之上；(4)在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。所述的自杀基因包含胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧唳脱氨酶(Cytosine deaminase,⑶)基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶(Ε.col1-gpt)基因、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、硝基还原酶(Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxypeptidase G2)基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶(E.col1-DeoD)基因、白喉毒素(DTA)基因和FAS基因中的任何一种或一种以上；所述的支持细胞指的是对目的细胞起到支持和营养作用，可维持目的细胞的生物学活性的细胞；所述的支持细胞包含成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、角膜基质细胞中的任何一种或一种以上；所述的转染方法为病毒或非病毒转染方法；所述的病毒转染方法包含利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、人类疱疫病毒载体、细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中的任何一种或一种以上；所述的非病毒转染方法包含阳离子聚合物转染法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法、二乙氨乙基葡聚糖介导转染法、直接注射法、电穿孔法、激光辐射法、磁性微粒法和基因枪法中的任何一种或一种以上；所述的目的细胞种植方法指的是目的细胞与支持凝胶混合后进行种植；所述的支持凝胶包含纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶、胶原凝胶、纳米多肽凝胶、天然生物凝胶中的任何一种或一种以上；所述的目的细胞包含全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或一种以上；所述的目的细胞进一步优选为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞中任何一种或一种以上；所述的启动支持细胞的自杀基因指的是在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，利用低毒或无毒的药物前体与支持细胞中携带自杀基因编码的特异性酶类作用而导致携带该基因的支持细胞凋亡；所述的药物前体包含无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、6-甲氧基阿糖核苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷、羧肽酶、异环磷酰胺、N-芳香本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：（1）把自杀基因转染到支持细胞中；（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；（3）把目的细胞种植于支持细胞之上；（4）在目的细胞之间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。

【技术特征摘要】
1.一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)把自杀基因转染到支持细胞中； (2)在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞； (3)把目的细胞种植于支持细胞之上； (4)在目的细胞之间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。2.根据权利要求1所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于: 所述的自杀基因包含胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因、白喉毒素基因和FAS基因中的任何一种或一种以上； 所述的支持细胞指的是对目的细胞起到支持和营养作用，可维持目的细胞生物学活性的细胞； 所述的转染方法为病毒或非病毒转染方法； 所述的目的细胞包含全能干 细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或一种以上。3.根据权利要求2所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于: 所述的支持细胞包含成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、角膜基质细胞中的任何一种或一种以上； 所述的目的细胞包含胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞中的任何一种或一种以上。4.根据权利要求2所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于: 所述的病毒转染方法包含利用逆转录病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：武征，王颖薇，蔡冬青，张建华，禹艳红，林熙，秦俊文，齐绪峰，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：