一种生产表皮细胞抑素的工艺及用途制造技术

一种生产表皮细胞抑素的工艺，其特征是取新鲜宰杀动物皮，清洗并去除脂肪等杂质后，切成０．５－１．０ｃｍ↑［２］小片，按１∶２加入水，匀浆４℃浸泡过夜，过滤，滤液加３０％乙醇，过滤，滤液加乙醇至８５％，４℃过夜，离心，取沉淀，加水溶解，ｐＨ调至７．５，离心得上清，上清通过超滤截取分子量１－１０万，的部分通过离子交换纤维素层析０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液ｐＨ６．８收集穿过峰，通过Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ－２００凝胶过滤，活性峰在峰Ⅳ中，通过离子交换－凝胶柱层析，活性部分在峰ⅠⅡ中，透析，收集透析内液即为表皮细胞抑素。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化分离纯化技术。
技术介绍
表皮细胞抑素(Epidermal Chalone)是存在于哺乳动物皮肤中的一种蛋白质，分子量5.2-6.7万道尔顿，化学性质不完全清楚，具有可阻止表皮细胞生物周期的生物活性，使细胞分裂停止在G1期。抑素这名词是Bullough在1960年提出的，抑素有很多种，存在于不同的组织中，已知的有淋巴细胞抑素、白细胞抑素、肝细胞抑素、表皮细胞抑素等。这是一类内源性抑制物，可阻断细胞生物周期，它们具有组织特异性、种属非特异性、作用可逆性和非细胞毒这四大共同的特性，但迄今为止对抑素的化学性质还知之甚少，也未见抑素应用的报导。表皮细胞抑素是从动物皮肤中提取的一种蛋白质，具有很明显的抑制表皮细胞增殖分化的作用，对于像牛皮癣和头屑过多等角质细胞过度增殖的症状应该是比较对症的治疗。本专利技术前，虽有从动物皮中提取抑素的报导，但没有得到纯品，对其生化性质未作深入研究，亦未见有关抑素应用的报导。牛皮癣的学名是银屑病，它是一种慢性的皮肤顽症，病因还不太清楚，是一种多基因控制的遗传疾病，但又与环境有密切关系，因为环境会改变其基因表达的程度，从而影响基因变异的表型，这给病因的研究和治疗带来极大的困难，银屑病因体表复盖很厚的角质层及难忍的搔痒，不但影响外观还严重降低生活质量，搔抓皮肤容易引起感染。严重的全身脱落性皮炎和红皮病，还有致死的危险。我国银屑病的发病率为1-2‰，全国大约有100-200万病人，国外发病率比我国还高，但目前世界上还没有专一有效的药物可以根治此病，所有治疗措施都只能达到暂时缓解。目前采用所谓“1-2-3”逼近疗法，第一阶段外用药如精制煤焦油，类固醇药物，维生素D3衍生物等，这些药对缓解病情有一定疗效，但有的药会污染皮肤、衣物，还有难闻的气味，有的对皮肤有刺激作用，不能用于脸部和生殖器，有的药有光敏反应。第二阶段用紫外线B或紫外线A加药物照射，即所谓光疗。但光疗必须在医生严密监护下使用，控制照射剂量和暴露时间，防止引起皮肤癌。此外还必须保护好眼睛防止引起白内障。第三阶段用内服药，所有内服的药物无一例外都有严重的毒付作用，有些是肿瘤药物，毒性很大，有的药对免疫功能有抑制作用，长期使用有可能引起淋巴肉瘤及其它肿瘤，所以一般不到严重程度不用口服药治疗。还有许多其它疗法如摄生疗法、交替疗法、顺势疗法、饮食疗法乃至死海泥疗法对有些人有一定改善，但很难真正控制病情。表皮细胞抑素虽然在60年代已经发现，但并没有人将之用于牛皮癣的治疗，对其性质亦未作进一步深入研究，我们在十多例病人中试验，观察外用表皮细胞抑素对皮屑的生成有非常明显的抑制作用，有效和缓解率在90％以上，而且十分安全，未发现付作用。
技术实现思路
1.专利技术目的本专利技术的目的是寻找一种安全、有效、纯天然的、毒付作用低的治疗银屑病的外用药物。2.专利技术技术方案本专利技术从哺乳动物的皮肤中用水抽提，提取液用乙醇分级沉淀，取30％-85％的沉淀部分，通过超滤去除分子量大于10万的杂蛋白，再通过凝胶过滤和离交凝胶层析，收集各部分，进行活性测定。根据对表皮细胞生长抑制的百分率定出单位((抑制生长1％定为一个活性单位)，按10U/g冷霜的比例加入冷霜中，作为牛皮癣的外用搽剂。3.专利技术效果表皮细胞抑素对人包皮细胞、鸡胚表皮细胞和阴道表皮细胞的生长均有明显的抑制作用。(1).鸡胚表皮细胞测定法(体外法)取鸡胚表皮剪碎后，置培养瓶中使细胞贴壁生长，然后消化成细胞悬液，加入96孔板中，并加入抑素共同培养，以MTT法检查细胞的生长，此法亦适用于包皮细胞)结果如下表皮细胞有丝分裂抑制百分率组别 抑素浓度mg/ml 抑制百分率(％)对照组生理盐水0低剂量组 0.025 63.6中剂量组 0.0581.2高剂量组 0.2590.9鸡胚表皮细胞生长快速，对抑素很敏感，在分离纯化中作为监控手段十分有利。(2).阴道表皮细胞法(体内法)雌性小白鼠腹腔注射己烯雌酚，刺激阴道细胞增殖，然后灌注表皮抑素，早晚各一次，腹腔注射阻断剂秋水仙素，取阴道制成切片，显微镜观察表皮细胞中有丝分裂细胞的百分数，结果如下表皮细胞抑素对小鼠阴道表皮细胞有丝分裂的抑制百分率(n＝3)组别 抑素浓度mg/ml有丝分裂细胞％抑制％对照 生理盐水 30.5低剂量组 1mg/ml(0.05ml) 9.12 70中剂量组 2.5mg/ml(0.05ml) 10.1 66.9高剂量组 25mg/ml(0.05ml) 8.79 71.2三组结果无明显差别，表示低剂量(1mg/ml)已达最高抑制百分率以上结果证明提取所得的制品无论体内外试验均有很高的抑制活性。牛皮癣病人局部早晚各搽一次抑素搽剂，2-3周皮屑脱尽，症状减轻，疗效显著，未发现毒付作用。四附图说明图1为通过10万膜超滤的超滤液，上DEAE纤维素柱层析的图谱，层析柱以0.02M PBS pH7.0平衡，上样后穿过部分出现两个峰，其中第一部分平缓、较宽且混浊，第二部分很陡峭、澄清，是所有蛋白峰中最高的一个峰。图2为DEAE的穿过峰II，再上Sephacryl S-200凝胶柱的分离图，共得6个峰，峰IV为其中最高的峰，也是活性部分。图3为Sephacryl S-200凝胶柱分离所得的活性峰，峰IV再通过DEAE-Sephadex柱的洗脱图谱，洗脱是500ml PBS按0-0.5mol/L的氯化钠梯度洗脱，共得5个蛋白峰，最早出现的PI、PII是两个最大的活性峰。五具体实施例方式取新鲜宰杀动物皮3090g，去皮脂，切块加水匀浆，4℃浸泡过夜，过滤得滤液4.3L，加95％医用乙醇至30％，冰箱放置1小时。滤纸过滤，收集滤液得6.05L加乙醇至85％，pH5.0，冰箱过夜，离心，沉淀加水溶解，pH7.5，8000rpm 15min.沉淀再次溶解，离心，合并上清液，得204ml，共得11.022g，通过超滤截留分子量1万-10万部分，得到蛋白质1.8g，通过DEAE-离子交换纤维素柱，得到二个穿过峰，第一个穿过峰比较平缓、混浊，第二个穿过峰比较陡峭、澄清，收集此峰II得612mg，结果见图1。将峰II通过Sephacryl柱得到6个蛋白峰，其中III峰比较靠近，IV VI峰比较陡峭，III V峰比较小，经测活，活性集中在最大的峰IV中。收集峰IV得到440mg，结果见图2，将峰IV再通过DEAE-Sephadex-A 25凝胶，用0-0.5mol/L的氯化钠梯度洗脱，共得到5个峰，最早出现的也是最大的峰I、峰II，具有生物活性，得到峰I(PI)185mg，峰II(PII)47mg，结果见图3。权利要求1.一种生产表皮细胞抑素的工艺，其特征是取新鲜宰杀动物皮，清洗并去除脂肪等杂质后，切成0.5-1.0cm2小片，按1∶2加入水，匀浆4℃浸泡过夜，过滤，滤液加30％乙醇，过滤，滤液加乙醇至85％，4℃过夜，离心，取沉淀，加水溶解，pH调至7.5，离心得上清，上清通过超滤截取分子量1-10万，的部分通过离子交换纤维素层析0.02mol/L磷酸缓冲液pH6.8收集穿过峰，通过Sephacryl S-200凝胶过滤，活性峰在峰IV中，通过离子交换-凝胶柱层析，活性部分在峰III中，透析，收集透析内液即为表皮细胞抑素。2.根据权利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹤云，金以丰，张太平，汤国枝，袁达文，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：