基于液相芯片检测鲤春病毒血症病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相芯片检测鲤春病毒血症病毒的方法。本发明专利技术提供了辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本发明专利技术还保护辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。采用本发明专利技术提供的特异引物对鉴定鲤春病毒血症病毒具有良好的特异性。采用本发明专利技术提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定鲤春病毒血症病毒，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。本发明专利技术非常适合对进出境水生动物进行检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，更具体涉及。
技术介绍
鲤春病毒血症(spring viraemia of carp, SVC)又名鲤春病毒病，是一种急性、出血性传染病，为世界动物卫生组织(OIE)必须申报疫病之一。鲤春病毒血症由鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)病毒引起。鲤春病毒血症病毒又称鲤弹状病毒(Rhabdovirus carpio)。SVCV可感染锦鲤、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、草鱼和狗鱼等多种鱼类，但对鲤鱼最为敏感，鲤鱼是SVCV最主要的宿主。在渔场养殖里任何年龄的鲤鱼均可患SVC，冬春交替时忽高忽低的水温降低了鲤鱼免疫力，因此易在春季爆发。感染SVCV的鱼出现急性腹水和全身出血等临床病症。SVCV由水经鳃侵入鲤鱼，在鱼体内潜伏约20天后发病。在低水温中，病毒可以在被感染的鲤鱼血液中存活11周左右，即出现持续性的病毒血症时期。SVC流行于整个欧洲和北美，近年来流行呈扩至亚洲，对我国水产养殖业构成较大的威胁。目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐、检测周期长、且灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，具有特异性强、敏感性高的优点，但步骤相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，快速、灵敏，但是需要进行琼脂糖凝胶电泳并通过溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，更具体涉及。本专利技术提供了辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本专利技术还保护辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特异弓I物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的试剂盒。所述特异弓I物对或所述弓I物探针组合物可用于辅助鉴定鲤春病毒血症病毒。 本专利技术还保护一种辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组合物。本专利技术还保护一种辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；如果所述RT-PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的鲤春病毒血症病毒；如果所述RT-PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非鲤春病毒血症病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为153bp。所述待测病毒可为鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、草鱼出血病病毒、病毒性出血性败血症病毒或传染性胰脏坏死病病毒。本专利技术还保护另一种辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增后与所述探针Tl进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的鲤春病毒血症病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非鲤春病毒血症病毒。所述待测病毒可为鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、草鱼出血病病毒、病毒性出血性败血症病毒或传染性胰脏坏死病病毒。所述辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的方法具体包括如下步骤(液相芯片法):(I)以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；(2)制备微球悬液①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75 μ L (约含3 X IO6个微球)置于1.5mL离心管中，IOOOOg离心lmin,弃上清；②在步骤① 的离心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩涡混合，超声波处理30-60秒(400W的功率，每超声9秒停6秒)；③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针Tl，漩涡混合；④在步骤③的离心管中加入2.5 μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法:将IOmg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑤在步骤④的离心管中加入2.5μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法同上)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑥在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，IOOOOg离心lmin,弃上清；⑦在步骤⑥的离心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混匀，IOOOOg离心lmin,弃上清；⑧在步骤⑦的离心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重悬，得到微球悬液；(3)将步骤(I)的产物和步骤(2)得到的微球悬液进行杂交即为实验组，用TE缓冲液代替步骤(I)的产物即为对照组；将杂交体系混合均匀后98°C变性lOmin，然后在与杂交温度相同的温度下孵育15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L用I X TMAC杂交液稀释至500倍体积的SA-PE，48°C -54°C (优选为52°C)杂交15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L IX TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，置于BD FACSArray液相芯片仪中进行分析；如果LQRR ^ 3，检测结果为阳性；如果LQRR < 2，检测结果为阴性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS为实验组的荧光强度中位值，MFIB为对照组的荧光强度中位值。RT-PCR 扩增的反应程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。液相芯片是一种新型快速检测技术，集流式细胞术、纳米荧光微球、荧光信号数字处理和传统化学发光技术为一体，具有所需样本量少、检测周期短的优点。采用本专利技术提供的特异引物对鉴定鲤春病毒血症病毒具有良好的特异性。采用本专利技术提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定鲤春病毒血症病毒，除了良好的特异性外，还具有灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。本专利技术非常适合对进出境水生动物进行检测。附图说明图1为实施例2中的电泳图。图2为杂交温度为52°C时，BD FACSArray液相芯片仪的输出图谱。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。N-甲基咪唑(TE)、碳二亚胺购置美国BD公司。DL2000marker购于大连宝生物公司。RNA 提取试剂盒(TaKa Ra MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver4.0):大连宝生物公司，货号为DV819A。RT-PCR试剂盒(PrimeScript 本文档来自技高网...

【技术保护点】
辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

【技术特征摘要】
1.辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。2.辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的引物探针组合物，由权利要求1所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在制备辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的试剂盒中的应用。4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在辅助鉴定鲤春病毒血症病毒中的应用。5.辅助鉴定鲤春病毒血症病毒的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物。6.一种辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：方绍庆，贾鹏，孙明君，史秀杰，尹伟力，刘宁，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：